一种酶制剂、制备方法及其在催化合成植物甾醇酯中的应用技术

本发明专利技术提供了一种酶制剂、制备方法及其在催化合成植物甾醇酯中的应用，该方法包括用改性海藻酸钠大分子包裹住脂肪酶并填充在氨基功能化前驱体的孔隙内，接着利用CaCl2溶液与改性海藻酸钠发生反应，形成一个稳定的凝胶状态来提高脂肪酶的活性和稳定性，同时CaCl2溶液可以在氨基功能化前驱体表面形成一层物理吸附的盐层，这层盐层可以填充部分孔隙，使氨基功能化前驱体的孔径减小，避免脂肪酶自孔隙中脱落失活，方便后续回收利用。所制得的酶制剂活性高，稳定性良好，可重复利用，有望促进植物甾醇酯绿色工业化生产。物甾醇酯绿色工业化生产。物甾醇酯绿色工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种酶制剂、制备方法及其在催化合成植物甾醇酯中的应用


[0001]本专利技术涉及生物催化
，具体涉及一种酶制剂、制备方法及其在催化合成植物甾醇酯中的应用。

技术介绍

[0002]甾醇根据其来源的不同，可分为动物性甾醇、植物性甾醇和菌类甾醇。动物性甾醇以胆固醇为主，植物甾醇主要为β
‑
谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇等，菌类甾醇主要是麦角甾醇。其中植物甾醇广泛存在于各类植物中，具有降低胆固醇含量、抗肿瘤、预防心血管疾病、抗炎、抗癌等功能，被称为“生命的钥匙”。然而植物甾醇不能在人体内内源性合成，必须从饮食中通过肠道吸收而获得。并且植物甾醇不溶于水，在油中的溶解度也相当有限，其熔点也很高，这些缺点限制了它的应用。为了扩大植物甾醇在食品中的应用，需要通过化学或物理改性来提高其溶解性、分散性，从而提高其生物利用度。植物甾醇酯化就是重要的改性手段之一，酯化后的植物甾醇酯溶解性得到改善，吸收率得到提高。因此，植物甾醇酯化是十分必要的，而选择一种绿色高效的方式制备植物甾醇酯又是一个很值得我们探索与研究的课题。
[0003]目前已经有很多关于合成植物甾醇酯方面的技术，例如中国专利文献(CN101845473A)公开了一种高效合成植物甾醇酯的方法，采用生物法制备植物甾醇酯，但固定化酶的固定方式不够牢固，容易在反应中脱落，导致酶的回收困难。中国专利文献(CN102161687A)公开了植物甾醇酯的制备方法，所用有机溶剂有一定的毒性，不仅会对酶的稳定性产生负面影响，导致酶的失活，而且还限制了其在食品领域中的应用。中国专利文献(CN101235067A)公开了一种植物甾醇酯的制备方法，在植物甾醇酯的合成中采用无溶剂体系，但反应温度高，容易破坏酶结构，使其失去催化活性，且对于能源的消耗大。

技术实现思路

[0004]针对目前催化合成植物甾醇酯技术中存在酶易脱落失活、难以回收的问题，本专利技术提供了一种酶制剂及其制备方法，利用氨基功能化前驱体与改性海藻酸钠相互作用形成的酰胺键将脂肪酶紧密包裹其中，接着利用CaCl2溶液与改性海藻酸钠发生反应，形成一个稳定的凝胶状态来提高脂肪酶的活性和稳定性，同时CaCl2溶液可以在氨基功能化前驱体表面形成一层物理吸附的盐层，这层盐层可以填充部分孔隙，使氨基功能化前驱体的孔径减小，避免脂肪酶自孔隙中脱落失活，方便后续回收利用。
[0005]本专利技术是通过以下技术手段实现上述技术目的的。
[0006]一种酶制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007]S1：将多孔载体溶于有机溶剂中，加入氨丙基三乙氧基硅烷，水浴搅拌、离心、干燥后得到氨基功能化前驱体；
[0008]S2：将海藻酸钠溶于去离子水中，用稀盐酸调节溶液ph值至3～5，随后加入EDC和NHS，混合反应结束后得到改性海藻酸钠溶液；
[0009]S3：将氨基功能化前驱体置于改性海藻酸钠溶液中，于恒温加热搅拌器内反应，反应结束后离心分离固体，干燥后得到新型载体；
[0010]S4：将新型载体加入到游离脂肪酶溶液中，水浴搅拌后得到物理吸附固定化酶溶液；
[0011]S5：将物理吸附固定化酶溶液滴加到CaCl2溶液中，静置固化，过滤，洗涤，干燥后得到酶制剂。
[0012]进一步地，步骤S1中，所述多孔载体包括介孔分子筛、蛭石、黏土矿物、硅藻土、活性炭、氧化铝、二氧化钛、四氧化三铁、氧化锌、碳纳米管、硅纳米管、单壁纳米管、尼龙、COF、MOF中的一种或多种；所述多孔载体、有机溶剂与氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为0.5g：70mL：2mL；所述水浴搅拌温度为80℃，搅拌时间为2h。
[0013]进一步地，步骤S2中，所述海藻酸钠、去离子水、EDC和NHS的用量比为5g：150mL：5g：3g。
[0014]进一步地，步骤S3中，所述氨基功能化前驱体与改性海藻酸钠溶液的用量比为1g：100mL；所述恒温加热搅拌器的具体参数为：温度：30℃；搅拌速度：200r/min；搅拌时间：20h。
[0015]进一步地，步骤S4中，所述游离脂肪酶来源于米曲霉、猪胰脏、伯克霍尔德氏菌、念珠菌属、疏绵状嗜热丝孢菌、米赫根毛霉、荧光假单胞菌、爪哇毛霉菌、黑曲霉、洋葱伯克氏菌、南极假丝酵母、沙门柏干酪青霉菌中的一种或多种。
[0016]进一步地，所述游离脂肪酶酶溶液的质量分数为2％；新型载体与游离酶溶液的用量比为0.3g：15mL；所述水浴搅拌温度为30℃，搅拌时间为1h。
[0017]进一步地，步骤S5中，所述CaCl2溶液浓度为5～25g/L；滴加时滴管距离液面高度为3～15cm；静置固化时间为10～60min；洗涤方式为用氯化钠溶液反复洗涤。
[0018]以上任一项制备方法所制得的酶制剂。
[0019]上述酶制剂在催化合成植物甾醇酯中的应用，将植物甾醇溶于脂肪酸后加入上述酶制剂，置于水浴摇床进行酯化反应，结束后分离纯化，得到植物甾醇酯，其中所述植物甾醇与脂肪酸的摩尔比为1:1～1:5；酶制剂的添加量占植物甾醇和脂肪酸质量之和的0.5～12wt％。
[0020]进一步地，所述植物甾醇为β
‑
谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇或菜籽甾醇；所述脂肪酸为月桂酸、豆蔻酸、硬脂肪酸、软脂肪酸、花生酸、山箭酸、棕榈(软)油酸、油酸、异油酸、神经酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸中的一种或多种；所述水浴摇床的温度为35
‑
60℃；水浴摇床的反应时间为2～24h。
[0021]本专利技术的有益效果如下：
[0022]1.本专利技术采用包埋法和物理吸附法两种方法相结合进行酶固定化，通过将脂肪酶包裹在改性海藻酸钠中并分布在氨基功能化前驱体的孔隙内，形成了“双载体”结构。氨基功能化前驱体表面具有氨基功能团，可以与改性海藻酸钠溶液中的羧基形成酰胺键，从而将脂肪酶固定在氨基功能化载体的孔隙内，增加其稳定性和反应效率。而CaCl2可以形成离子交联作用，将改性海藻酸钠中的负离子与Ca
2+
结合，形成一种强有力的凝胶结构，这种固化方法可以保证脂肪酶在催化过程中的稳定性和活性，延长脂肪酶的使用寿命。同时CaCl2还可以在氨基载体表面形成氯化钙晶体，填充载体孔隙，从而缩小其孔径大小，将包裹住脂
肪酶的改性海藻酸钠大分子彻底包裹在氨基功能化前驱体的孔隙内，避免脂肪酶自孔隙中脱落失活，方便后续回收利用。
[0023]2.本专利技术着重于制备一种新型的脂肪酶固定化载体，将脂肪酶固定在载体上，用于植物甾醇酯化的高效催化。催化反应完成后，固定化酶可回收利用，降低了成本，具有良好的商业前景。
[0024]3.本专利技术采取的脂肪酶固定化技术，实现了新型固定化酶制剂催化制备植物甾醇酯，反应条件温和，操作简单，并且酶催化剂可重复利用，选择性高，所采用的试剂没有毒性，对环境污染小。
附图说明
[0025]图1为本专利技术所述催化合成植物甾醇酯的流程图。
具体实施方式
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将多孔载体溶于有机溶剂中，加入氨丙基三乙氧基硅烷，水浴搅拌、离心、干燥后得到氨基功能化前驱体；S2：将海藻酸钠溶于去离子水中，用稀盐酸调节溶液ph值至3～5，随后加入EDC和NHS，混合反应结束后得到改性海藻酸钠溶液；S3：将氨基功能化前驱体置于改性海藻酸钠溶液中，于恒温加热搅拌器内反应，反应结束后离心分离固体，干燥后得到新型载体；S4：将新型载体加入到游离脂肪酶溶液中，水浴搅拌后得到物理吸附固定化酶溶液；S5：将物理吸附固定化酶溶液滴加到CaCl2溶液中，静置固化，过滤，洗涤，干燥后得到酶制剂。2.根据权利要求1所述酶制剂的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述多孔载体包括介孔分子筛、蛭石、黏土矿物、硅藻土、活性炭、氧化铝、二氧化钛、四氧化三铁、氧化锌、碳纳米管、硅纳米管、单壁纳米管、尼龙、COF、MOF中的一种或多种；所述多孔载体、有机溶剂与氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为0.5g：70mL：2mL；所述水浴搅拌温度为80℃，搅拌时间为2h。3.根据权利要求1所述酶制剂的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述海藻酸钠、去离子水、EDC和NHS的用量比为5g：150mL：5g：3g。4.根据权利要求1所述酶制剂的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述氨基功能化前驱体与改性海藻酸钠溶液的用量比为1g：100mL；所述恒温加热搅拌器的具体参数为：温度：30℃；搅拌速度：200r/min；搅拌时间：20h。5.根据权利要求1所述酶制剂的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹彬，张雨阳，夏姣姣，冯婷，钱静亚，王锋，霍书豪，崔凤杰，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：