检测样品中结直肠癌基因的引物组在制备用于检测结直肠癌复发风险的试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种检测样品中结直肠癌基因的引物组在制备用于检测结直肠癌复发风险的试剂盒中的应用，可用于结直肠癌3基因检测，由基因表达量计算来获得结直肠癌的复发风险预测。本试剂盒适用广泛，对于科研和临床检测都适用，单样品或多样品，都能使用本试剂盒，检测结果快速准确。检测结果快速准确。检测结果快速准确。

【技术实现步骤摘要】
检测样品中结直肠癌基因的引物组在制备用于检测结直肠癌复发风险的试剂盒中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种检测样品中结直肠癌基因的引物组在制备用于检测结直肠癌复发风险的试剂盒中的应用。

技术介绍

[0002]结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，近20年来，以手术为中心，化疗、放射治疗为辅助的多学科综合治疗模式得到长足的发展，使结直肠癌的复发和死亡率显著降低，但仍然缺乏有效的方法能够较为准确地预测患者的复发风险并给予相应的治疗。
[0003]目前多基因检测的试剂盒一般采用Taqman荧光PCR法、SYBR Green法。Taqman荧光PCR法，需要设计引物和探针，简单的Taqman法只需设计一对引物和一条探针即可，而多重荧光PCR需要设计多对引物和探针，并且要保证多重PCR的各个引物之间不相互干扰以及各个探针之间不相互干扰，这就对引物和探针的要求比较高，设计难度大、实验成本高。此外，多重PCR对PCR的缓冲液和QPCR仪器都有一定的要求。而SYBR Green法只需设计一对引物，在反应时需要加入SYBRGreen荧光染料即可。最大优点是通用性强，适用于所有的荧光定量PCR反应。并且通过对PCR产物的熔解曲线进行分析，可以使非特异性扩增的问题得以解决，从而保证荧光信号的特异性。因此，我们需要找到一种特异性强、灵敏度高，操作简便，数据准确的多基因检测试剂盒和方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的在于提供检测样品中结直肠癌基因的特异性强、灵敏度高，操作简便，数据准确的引物组在制备用于检测结直肠癌复发风险的试剂盒中的应用。
[0005]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了检测样品中结直肠癌基因的引物组在制备用于检测结直肠癌复发风险的试剂盒中的应用，检测样品中结直肠癌基因的引物组在制备用于检测结直肠癌复发风险的试剂盒中的应用，
[0006]其中检测NMU基因的引物序列为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，具体序列如下：
[0007]NMU：
[0008]F：5
‘‑
CTCAGGCATCCAACGCACT
‑3’
(SEQ ID NO.1)
[0009]R：5
‘‑
GACTTGCCCAACTTCTGTGTC
‑3’
(SEQ ID NO.2)
[0010](2)检测DCBLD2基因的引物序列为：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，具体序列如下：
[0011]DCBLD2：
[0012]F：5
‘‑
ATAATGGAATTGGAGTCAGCAG
‑3’
(SEQ ID NO.3)
[0013]R：5
‘‑
TTCCACTCATGAACAGCAATG
‑3’
(SEQ ID NO.4)
[0014](3)检测ZFYVE27基因的引物序列为：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，具体序列如下：
[0015]ZFYVE27：
[0016]F：5
‘‑
TGCCCTGCCTTTCTCAAGTA
‑3’
(SEQ ID NO.5)
[0017]R：5
‘‑
CCCAATTCCTCCTCATCCCA
‑3’
(SEQ ID NO.6)
[0018]优选的，对应检测同一种基因的引物组预混液，所述试剂盒包括分别对应结直肠癌3个基因的3种引物预混液。
[0019]优选的，对应检测同一种基因的引物组的浓度稀释到1
‑
500μM。
[0020]优选的，所述3种引预混液分别装在3个QPCR反应管中。
[0021]优选的，所述试剂盒中包括SYBR Green溶液；所述SYBR Green溶液包括含抗体介导热启动iTaq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、Green I染料、强化剂、稳定剂和惰性参比染料混合物。
[0022]本专利技术涉及一种试剂盒的检测方法，所述检测方法如下：
[0023]S1、将SYBR Green、待测样本的cDNA和ddH2O混匀后，取出分别加入到3种引物预混液中进行荧光定量PCR反应；
[0024]S2、通过荧光定量PCR扩增后获得的CT值来计算，对数据进行建模，预测结直肠癌患者的复发风险。
[0025]优选的，在步骤S1中，所述待测样本的cDNA是通过包括如下步骤的方法制备而得：提取结直肠癌石蜡标本的RNA，将提取得到的RNA反转录成cDNA。
[0026]优选的，在步骤S1中，所述荧光定量PCR反应的反应条件均为：95℃预变性3min；95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延申30秒，40
‑
45个循环。
[0027]本专利技术的试剂盒和检测方法可用于结直肠癌3基因检测，由基因表达量计算来获得结直肠癌的复发风险预测。对原始PCR数据，首先用管家基因进行正则化处理。将正则化处理后的数据送入模型，筛选出3个基因用于预测结直肠癌的复发风险。生物信息学分析方法采用基于Lasso回归筛选变量构建Cox比例风险回归模型的方法。
[0028]结直肠癌的复发风险评估系统是基于RT
‑
QPCR的方法通过精确计算来检测肿瘤组织中的3个与肿瘤相关的目的基因表达，即结直肠癌3基因检测，可用于有效预测结直肠癌II期及III期患者的复发风险。结直肠癌3基因包含3个结直肠癌相关基因(NMU、DCDLB、ZFYVE27)。
[0029]3基因检测需要从石蜡包埋切片中提取RNA，逆转录成cDNA，再通过基因扩增技术准确的对3基因进行检测。
[0030]本专利技术的有益效果是：
[0031]1.本试剂盒采用的是SYBR Green法，SYBR Green法只需设计一对引物，在反应时需要加入SYBR Green荧光染即可。最大优点是通用性强，适用于所有的荧光定量PCR反应。并且通过对PCR产物的熔解曲线进行分析，可以使非特异性扩增的问题得以解决，从而保证荧光信号的特异性。
[0032]2.由于石蜡包埋样本的RNA有部分是降解的，所以本试剂盒中3个基因各设计了1对引物，每1对引物段大小都小于200bp，这就提高了降解RNA反转录后QPCR的扩增效率；
[0033]3.本试剂盒中每个基因的1组引物放在一个反应管中，在QPCR扩增过程中只需使用一种缓冲液，这就简化了实验操作；在扩增结束后每个基因都能在QPCR上看到1条扩增曲线，得到清晰精确的CT值，使计算结果更精确可信；
[0034]4.本试剂盒所涉及的引物，其退火温度都在56℃左右，这就可以使3种基因使用同一程序进行扩增；通过添加溶解曲线，就能直接观察到PCR结果；
[0035]5.本试剂盒适用广泛，对于科研和临床检测都适用，单样品或多样品，都能使用本试剂盒，检测结果快速准确本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测样品中结直肠癌基因的引物组在制备用于检测结直肠癌复发风险的试剂盒中的应用，其中a.检测NMU基因的引物序列为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，具体序列如下：NMU：F：5
‘‑
CTCAGGCATCCAACGCACT
‑3’
(SEQ ID NO.1)R：5
‘‑
GACTTGCCCAACTTCTGTGTC
‑3’
(SEQ ID NO.2)b.检测DCBLD2基因的引物序列为：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，具体序列如下：DCBLD2：F：5
‘‑
ATAATGGAATTGGAGTCAGCAG
‑3’
(SEQ ID NO.3)R：5
‘‑
TTCCACTCATGAACAGCAATG
‑3’
(SEQ ID NO.4)c.检测ZFYVE27基因的引物序列为：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，具体序列如下：ZFYVE27：F：5
‘‑
TGCCCTGCCTTTCTCAAGTA
‑3’
(SEQ ID NO.5)R：5
‘‑
CCCAATTCCTCCTCATCCCA
‑3’
(SEQ ID NO.6)2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈利民，张雨时，曹青，史嘉敏，孙西予，
申请(专利权)人：天津云检医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：