抗甲型流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了抗甲型流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用，包括1号克隆抗体和2号克隆抗体，1号克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，1号克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；2号克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，2号克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。制备方法：将亲和纯化后的流感病毒核蛋白与弗氏佐剂进行等体积混合乳化，进行免疫，采集小鼠血液分离血清，筛选免疫较好的小鼠进行杂交瘤融合实验，培养基筛选培养后，筛选出阳性细胞株，克隆出单克隆细胞株。此抗体组合具有特异性和高亲和力的特点，同时也提供了上述抗体的诊断检测试剂盒，从而提高诊断试剂的特异性和灵敏度。提高诊断试剂的特异性和灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
抗甲型流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于抗体的制备及序列测定领域，具体涉及抗甲型流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体。
[0002]本专利技术还涉及抗甲型流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体的制备方法和应用。

技术介绍

[0003] 流感病毒（Influenza virus）属于正粘病毒科流感病毒属的单股负链RNA病毒，可根据流感病毒的核衣壳蛋白（Nucleoprotein，NP）和基质蛋白（Matrix，M）的不同特性，将流感病毒分为甲型流感病毒（Influenza A virus），乙型流感病毒（Influenza B virus），丙型流感病毒（Influenza C virus）和丁型流感病毒（Influenza D virus）。其中甲型流感病毒主要感染人类和各种动物，乙型和丙型主要感染的宿主是人类，丁型流感病毒主要感染猪和牛。甲型流感病毒最容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。根据病毒表面的血凝素HA和神经氨酸酶NA抗原不同，将甲型流感分为许多亚型，H可分为18个亚型(H1
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H18)，N有11个亚型(N1
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N11 )。据统计20世纪期间有4次较大规模的甲型流感病毒大流行，分别是1918年西班牙H1N1流感，1957年H2N2亚洲流感，1968年H3N2流感和2009年H1N1墨西哥流感，近年来，高致病性禽流感（H5N1）也不断地威胁着人类的生命健康，流感的季节性流行和大流行造成全世界范围内的人类和动物的发病和死亡，对全球公共卫生安全、经济发展和社会稳定造成巨大的威胁。
[0004]流感病毒核蛋白（Nucleoprotein，NP）由第5条基因编码，498个氨基酸组成，是流感病毒的重要结构蛋白，约占病毒颗粒的25%，NP蛋白在不同亚型的甲流病毒中高度保守，氨基酸同源性很高，差异性不超过11%，具有种群和型的特异性，可用于流感病毒型的区别诊断，是诊断流感病毒最具代表性的蛋白。具有很高的免疫原性，可以用于制备诊断用单克隆抗体。
[0005]甲型流感诊断试剂的核心原料是NP蛋白的单克隆抗体，大部分依赖于进口，国内厂商的特异性和灵敏度不高，无法准确检测甲型流感病毒的含量，会有漏检的情况，所以开发开发性能优异的甲型流感诊断试剂非常有必要。

技术实现思路

[0006]为解决灵敏性、特异性的问题，本专利技术提供了抗甲型流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体。该抗体性能优异、准确性高。
[0007]同时提供甲型流感病毒抗原检测试剂盒，能准确检测甲型流感病毒的含量，为甲型流感诊断提供依据。
[0008]本专利技术提供如下技术方案：抗甲型流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体，包括1号克隆抗体和2号克隆抗体，1号克隆抗体的重链可变区氨基酸序列：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTIYFIHWVKQKPGQGLEWIAYINPYNDDIKYNEKFRGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAREDWLRFDNWGQGTTLTVSS1号克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列：DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYTSQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELK2号克隆抗体的重链可变区氨基酸序列：EVQLQQSGPEVVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWLKQSHGKSLEWIGHINPNNGGTAYNQKFKGKATLTVGKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRGYDYGRVHYFAMDYWGQGTSVTVSS2号克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列：DIQLTQSPASLSASVGESVTITCRASENIYSFLAWYQQKQGKSPQLLVYTVKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLHPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLELK抗甲型流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体的制备方法，将亲和纯化后的流感病毒核蛋白（NP蛋白）与弗氏佐剂进行等体积混合乳化，免疫计量为100ug/只小鼠，3周后进行加强免疫，免疫计量为50ug/只小鼠，后期间隔2周每次，采集小鼠血液分离血清，酶联免疫吸附测定抗体效价，筛选免疫较好的小鼠进行杂交瘤融合实验，经过HAT筛选培养基筛选培养后，取上清进行酶联免疫吸附测定，筛选出阳性细胞株，并进行两轮的细胞亚克隆，克隆出单克隆细胞株。
[0009]流感病毒核蛋白的亲和纯化：菌体用磷酸盐缓冲液重悬，高压均质机进行高压均质后，离心取上清，用重力柱进行亲和纯化，用梯度咪唑浓度进行洗杂和洗脱，进行SDS
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PAGE电泳，检测蛋白纯度，将蛋白透析至磷酸盐缓冲液中，0.22um过滤器无菌过滤后，BCA测定蛋白浓度。
[0010]流感病毒核蛋白的表达生产：将pET30a
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FluANP表达质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落进行诱导表达，在含有卡那霉素的LB培养基中培养，培养至OD600nm至0.6
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0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷进行诱导表达后收集菌体。
[0011]抗甲型流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体在制备甲型流感诊断试剂中的应用。
[0012]单克隆抗体用于甲型流感病毒抗原检测试剂盒。试剂盒使用1号克隆抗体和2号克隆抗体分别作为检测抗体和包被。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了抗甲型流感病毒核衣壳蛋白，具有种群和型的特异性和很高的免疫原性，用于制备诊断用单克隆抗体，用于流感病毒型的区别诊断，本专利技术的抗甲型流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体，此抗体组合具有特异性和高亲和力的特点，同时也提供了基于上述抗体的诊断检测试剂盒，从而提高诊断试剂的特异性和灵敏度。对于甲型流感病毒的诊断和流行病学调查具有很大的临床意义。
实施方式
[0014]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0015] 实施例1NP蛋白表达载体的构建
在NCBI官网上查找甲型流感病毒的NP蛋白氨基酸序列，在蛋白氨基酸加上组氨酸标签，利用密码子优化软件在大肠杆菌表达系统中优化密码子，基因合成后利用NdeI&XhoI限制性内切酶酶切位点，将基因克隆至pET30a表达载体中，构建pET30a
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FluANP表达质粒，并测序验证基因序列。
[0016] 实施例2NP蛋白的表达生产将pET30a
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FluANP表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落进行诱导表达，在含有50ug/ml的卡那霉素的LB培养基中培养，3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗甲型流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体，其特征在于：包括1号克隆抗体和2号克隆抗体，所述1号克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，1号克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述2号克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，2号克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.抗甲型流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：将亲和纯化后的流感病毒核蛋白与弗氏佐剂进行等体积混合乳化，免疫计量为100ug/只小鼠，3周后进行加强免疫，免疫计量为50ug/只小鼠，后期间隔2周每次，采集小鼠血液分离血清，酶联免疫吸附测定抗体效价，筛选免疫较好的小鼠进行杂交瘤融合实验，经过HAT筛选培养基筛选培养后，取上清进行酶联免疫吸附测定，筛选出阳性细胞株，并进行两轮的细胞亚克隆，克隆出单克隆细胞株。3.根据权利要求2所述的抗甲型流感病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：流感病毒核蛋白的亲和纯化：菌体用磷酸盐缓冲液重悬，高压均质机进行高压均质后，离心取上清，用重力柱进行亲和纯化，用梯度咪唑浓度进行洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：芮兵，
申请(专利权)人：南京佰抗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：