一种单链序列标记的引物、试纸条及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种单链序列标记的引物，包括第一正向引物、第一反向引物、第二正向引物、第二反向引物、第三正向引物、第三反向引物。这些引物特异性好、灵敏度高，能够用于检测牛肉中是否掺假了猪肉或鸡肉，或者被标为牛肉的商品肉是否属于牛肉成分。本发明专利技术还公开一种试纸条和应用，适用于肉类掺假的现场检测。适用于肉类掺假的现场检测。适用于肉类掺假的现场检测。

【技术实现步骤摘要】
一种单链序列标记的引物、试纸条及其应用


[0001]本专利技术涉及肉类掺假检测
，具体涉及一种单链序列标记的引物、试纸条及其应用。

技术介绍

[0002]肉类掺假是人们在日常生活中普遍关注的问题，由于其会对消费者造成重大经济损失，危害公众健康，损害肉类市场秩序，以及导致不公平竞争。普通的肉眼观察难以辨别在高价肉类中掺假的劣质、低成本肉类，从而导致了肉类产品的质量急剧下降。此外，大量非法生产商在加工肉制品包括火腿、香肠、培根和肉丸中掺假鸡肉、鸭肉和/或猪肉等肉而提高盈利的现象愈加严重。因此，开发一种简单、准确、高效的检测技术对于掺假肉制品而言是至关重要的。
[0003]目前，基于DNA的技术在肉制品的真实性检测中的应用越来越频繁，且DNA比蛋白质具有较好的热稳定性和物理稳定性以及高灵敏性和特异性。这些技术包括限制性片段长度多态性分析技术(PCR
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RFLP)、单链构象多态性分析技术(PCR
‑
SSCP)、DNA杂交、实时定量PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)、链置换扩增技术(SEA)以及重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等。然而，这些技术的局限性是难以扩增甚至不能扩增多个目标，且有的方法还需要昂贵的专用设备，它们并不适合用于现场检测。
[0004]多重检测技术的开发，对提高食品质量和安全性是迫切和必要的，同时它也是国际研究热点。其中，多重PCR使用多组物种特异性引物，可以在单管反应中扩增出两种及两种以上的肉类物种的模板DNA，节省了成本和时间。然而，多重PCR不能获得定量的结果，且需要一个后PCR检测步骤，即通过琼脂糖凝胶电泳根据扩增产物的尺寸大小进行分离。因此，研究人员们针对传统的多重PCR的缺陷开发了多重实时PCR。然而，其需要一种昂贵又复杂的仪器来读取来自报告分子和探针(如分子信标、TaqMan、Evagreen、SYBR Green)的荧光信号以及需要考虑其各种因素和反应条件。此外，荧光染料还不能通过识别颜色来实现多重检测。此外，多重等温扩增技术已经被开发用于多个目标进行检测，但也伴随了较多的缺点：如引物设计困难，易受气溶胶污染，酶的成本极其昂贵，且其不适合大规模检测，因为在一个反应体系中多个引物存在较大的错配风险。虽然高分辨率熔融曲线分析技术(HRMA)也可以同时区分多个目标物种，但需要具有专门仪器和专业操作人员的实验室。
[0005]核酸侧流试纸条(NALFS)由于其灵敏、特异、快速、稳健、经济、用户友好、免设备、可交付给最终用户等优点越来越受到研究者们的关注和应用。它拥有普通的侧流试纸条的结构和相似的信号报告，并将特异的DNA或RNA探针作为识别元素。并且该探针能够和固定在试纸条上的互补探针结合。为了实现多重检测，使用多重PCR结合核酸侧流试纸条(mPCR
‑
NALFS)技术来检测肉类掺假，并避免了复杂的葡聚糖凝胶电泳步骤。
[0006]胶体金(CG)在NALFS中是最常用的示踪信号，但它们不易用于多重检测，因为当检测线的数量在两个或两个以上时显示出的都是相同的红色，使用者可能会对检测结果引起困惑和误解。然而，乳胶微球(LMs)可以浸渍多种活性染料而显示很多不同的颜色，使用多
色的乳胶微球就可以避免上述引起争论的现象。正是如此，乳胶微球具有易于合成、多色、适用于侧流试纸条等优点，实现和增强了试纸条的不同颜色的比色能力和用户体验感。另外，为了得到用于试纸条的扩增产物，需要设计合适的引物。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供单链序列标记的引物，用于检测牛肉中是否掺假了猪肉或鸡肉，或者被标为牛肉的商品肉是否属于牛肉成分。
[0008]本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种试纸条。
[0009]本专利技术所要解决的第三个技术问题是提供一种应用。
[0010]本专利技术为解决上述第一个技术问题采用的技术方案为：一种单链序列标记的引物，其特征在于：
[0011]第一正向引物F1：
[0012]AATTCCCCAAATTGAA/TTTTTT/TACTGCAACGATGTAC/C12/CAACAGGAATCTCCTCAGACGTAGA；
[0013]第一反向引物R1：
[0014]CCTAAGGTTACTACGG/C12/GCTAGAATTAGTAAGAGGGCCCCTAA；
[0015]第二正向引物F2：
[0016]TGGCTAAATTAAACTG/TTTTTT/TACTGCAACGATGTAC/C12/TACCCAGCAAGCCCAGAATC；
[0017]第二反向引物R2：
[0018]CCAGTTACGACTATGG/C12/GAGATTGTGCGGTTATTAATGAGTC；
[0019]第三正向引物F3：
[0020]ACCGAGACCATGAACC/TTTTTT/TACTGCAACGATGTAC/C12/GCCATCCTACTACTCCTCACCA；
[0021]第三反向引物R3：
[0022]AGTTCTGAAGTCGTAT/C12/CCAGATTTTAGAGATTGGAAGTCA。
[0023]本专利技术为解决上述第二个技术问题采用的技术方案为：一种试纸条，其特征在于：所述试纸条包括PVC背板、设置在PVC背板上且依次沿样品流动方向分布、且依次部分重叠的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫；
[0024]所述样品垫用于接收采用如上述的第一正向引物F1、第二正向引物F2、第三正向引物F3和第一反向引物R1、第二反向引物R2、第三反向引物R3进行PCR扩增后的PCR产物；
[0025]所述结合垫涂布有第一识别探针与蓝色乳胶微球的复合物、第二识别探针与黑色乳胶微球的复合物、第三识别探针与粉色乳胶微球的复合物；
[0026]所述硝酸纤维膜沿样品流动方向依次间隔设置有第一检测线、第二检测线、第三检测线、质控线，所述第一检测线标记有用于检测鸡肉的第一检测探针，所述第二检测线标记有用于检测牛肉的第二检测探针，所述第三检测线标记有用于检测猪肉的第三检测探针，所述质控线标记有质控探针；
[0027]所述第一识别探针的序列为GGCTTGGGGTTTGGTTTTTTTT
‑
NH2；
[0028]所述第二识别探针的序列为GGTTCATGGTCTCGGTTTTTTT
‑
NH2；
[0029]所述第三识别探针的序列为CAGTTTAATTTAGCCATTTTTT
‑
NH2；
[0030]所述第一检测探针的序列为CCGTAGTAACCTTAGGTTTTTT
‑
Biotin；
[0031]所述第二检测探针的序列为ATACGACTTCAGAACTTTTTTT
‑
Biotin；
[0032]所述第三检测探针的序列为CCATAGTCGTAACTGGTTTTTT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单链序列标记的引物，其特征在于：第一正向引物F1：AATTCCCCAAATTGAA/TTTTTT/TACTGCAACGATGTAC/C12/CAACAG GAATCTCCTCAGACGTAGA；第一反向引物R1：CCTAAGGTTACTACGG/C12/GCTAGAATTAGTAAGAGGGCCCCTAA；第二正向引物F2：TGGCTAAATTAAACTG/TTTTTT/TACTGCAACGATGTAC/C12/TACCCAG CAAGCCCAGAATC；第二反向引物R2：CCAGTTACGACTATGG/C12/GAGATTGTGCGGTTATTAATGAGTC；第三正向引物F3：ACCGAGACCATGAACC/TTTTTT/TACTGCAACGATGTAC/C12/GCCATC CTACTACTCCTCACCA；第三反向引物R3：AGTTCTGAAGTCGTAT/C12/CCAGATTTTAGAGATTGGAAGTCA。2.一种试纸条，其特征在于：所述试纸条包括PVC背板、设置在PVC背板上且依次沿样品流动方向分布、且依次部分重叠的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫；所述样品垫用于接收采用如权利要求1所述的第一正向引物F1、第二正向引物F2、第三正向引物F3和第一反向引物R1、第二反向引物R2、第三反向引物R3进行PCR扩增后的PCR产物；所述结合垫涂敷有第一识别探针与蓝色乳胶微球的复合物、第二识别探针与黑色乳胶微球的复合物、第三识别探针与粉色乳胶微球的复合物；所述硝酸纤维膜沿样品流动方向依次间隔设置有第一检测线、第二检测线、第三检测线、质控线，所述第一检测线标记有用于检测鸡肉的第一检测探针，所述第二检测线标记有用于检测牛肉的第二检测探针，所述第三检测线标记有用于检测猪肉的第三检测探针，所述质控线标记有质控探针；所述第一识别探针的序列为GGCTTGGGGTTTGGTTTTTTTT
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【专利技术属性】
技术研发人员：蓝航镇，冯锦超，潘道东，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：