基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒及其应用制造技术

一种基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒，包括根据目标害虫亚洲玉米螟基因组中特异性DNA设计的引物对和Taqman荧光探针；所述亚洲玉米螟基因组特异性DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物对包括YZYMM

【技术实现步骤摘要】
基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及农业生物
，尤其涉及一种基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis属鳞翅目螟蛾科，是一种杂食性害虫，主要取食玉米，严重影响玉米的产量和质量。危害玉米植株地上的各个部位，使受害部分丧失功能，降低籽粒产量。在玉米心叶期，初孵幼虫大多爬入心叶内，群聚取食心叶叶肉，2、3龄幼虫大多爬入心叶内潜藏为害；此后，陆续蛀入茎秆继续为害，蛀孔口常堆有大量粪渣；雄穗被蛀，常易折断，影响授粉；苞叶、花丝被蛀食，会造成缺粒和秕粒；茎秆、穗柄、穗轴被蛀食后，形成隧道，破坏植株内水分、养分的输送，使茎秆倒折率增加，籽粒产量下降。初孵幼虫可吐丝下垂，随风漂移扩散到邻近植株上。对亚洲玉米螟的有无进行定性检测，并对其密度进行定量测定，对控制其虫害及防治具有一定的指导作用。通过对害虫生物残留物DNA的定量测定，可以得到更精确的分析结果。因为每个物种的DNA都具有特定的基因序列，所以我们只要根据这些特异性的基因序列，就可以制得此序列的荧光探针。将特定的荧光探针与我们得到的环境DNA进行融合并扩增，然后用qPCR技术进行定量分析，可以通过荧光颜色和荧光强度的差别来判断害虫的种类，然后通过对相应害虫曲线的进行分析，得到它们的环境DNA含量，以此来判断污染农作物的害虫种类和估算虫害破坏的规模。以此为依据来减少因害虫而带来的经济损失，为来年防治害虫提供了重要的参考。
[0003]然而当前大多数的专利技术都是围绕害虫图像自动检测识别的技术，通过采集害虫标本建立物理特征性数据库(音频、图像等)、监控生境获取害虫物理特征，从而对害虫进行分析识别，最终获得害虫的种属和分布信息。如中国专利申请CN201820022929.8：一种害虫检测装置，专利技术人构建多种物理性传感器，使传感器的输出端与控制器的输入端相接，控制器再与网络通信模块相连，通过各部件的配合，能采集大量经过传感器的害虫的信息。此害虫检测装置可以采集大量现场的图像数据、害虫经过传感器的数量以及害虫检测附近的声音，便于研究人员通过图像数据、害虫经过传感器的数量分析害虫的种类和规模，因而表现出高效、灵敏的特点。但此项装置在害虫检测检疫的准确度方面，由于害虫所处复杂的背景、众多的干扰因素、装置的多重标准以及研究人员判断与分析的误差，使得检测的结果并不十分客观，因此准确度上还有待提高。此类物理检测装置和检测方法存在着相似的优点和不足——即灵敏度高，但特异性差。
[0004]近年来，兴起的基于昆虫遗留在环境中的DNA(eDNA)的定量检测技术实现了物种检测中的高特异性和高效性的统一。但由于各类昆虫eDNA的释放量和富集难易程度不一样，目前大多专利技术应用在水生生境中，例如：N201610662966.0中华鲟环境DNA检测PCR扩增引物及其检测方法和应用；CN201920125138.2一种收集海水中环境DNA的装置；CN201510005835.0用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法；CN201510640527.5基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法等等，都是针对水生生境的环境DNA。
[0005]另有极少数专利与陆生生境的环境DNA相关，如CN200710066211.5一种快速提取植物根际土中AM真菌环境DNA的方法；CN201910525589.X一种检测环境微生物砷氧化基因物种组成的PCR引物及方法。但这些专利都无一例外地是以微生物为检测对象，鲜有基于环境DNA技术的害虫检测方面的专利技术。陆生害虫的定量检测仅见极少数报道(如Valetine等人2018年发表的关于茶翅椿的研究)。与水体的环境DNA相比，陆生生物的环境DNA比较难获取。陆生害虫分布区域广泛且种类繁多，大多体积较小，尤其是亚洲玉米螟一般会分布在玉米心叶的位置，正常活动所遗留在环境中的DNA量甚微，不容易集中到滤膜上进行采样，检测的敏感性低。且环境DNA难以提取和分离，采集区域的DNA并不一定是研究区域的生物DNA，容易出现假阳性与假阴性，还易发生交叉污染，而本专利技术则需克服并改进现有技术，尽量提高检测的敏感性，达到早期预防虫害的目的。
[0006]现有的陆生农业害虫检测技术多需要针对虫体本身进行判断，识别监测过程中难以排除外界诸多干扰因素的影响，使技术人员不能做出十分客观的判断。且单次检测对象单一、时效性差、耗时耗力。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒及其应用。
[0008]为达到以上目标，本专利技术所采用的技术方案是：一种基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒，包括根据目标害虫亚洲玉米螟基因组中特异性DNA设计的引物对和Taqman荧光探针；所述亚洲玉米螟基因组特异性DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物对包括YZYMM
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F和YZYMM
‑
R，所述YZYMM
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F的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述YZYMM
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R的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；所述Taqman荧光探针的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；所述试剂盒还包括聚碳酸酯蚀滤膜(Φ＝10μm)和缓冲试剂。
[0009]所述的陆生环境DNA检测试剂盒在陆生环境检测亚洲玉米螟的应用。
[0010]其应用方法如下：
[0011]S1、取玉米心叶样本在去离子水中震荡漂洗得到漂洗液；
[0012]S2、用卡默尔蠕动泵和直径47mm、孔径10um的Millipore聚碳酸酯蚀滤膜过滤所述漂洗液，使eDNA富集在所述聚碳酸酯蚀滤膜上；
[0013]S3、收集所述eDNA，用权利要求1或2中所述的试剂盒进行qPCR反应，根据扩增反应曲线中的Cq值来判断环境中是否含有亚洲玉米螟。当实验组Cq值大于NTC组Cq值，说明环境中含有亚洲玉米螟。
[0014]所述的陆生环境DNA检测试剂盒在陆生环境检测亚洲玉米螟的应用还包括定量检测方法，方法如下：
[0015]S4、提取亚洲玉米螟的基因组DNA，将所述基因组DNA进行梯度稀释；
[0016]S5、用权利要求1或2中所述的试剂盒进行qPCR反应，用权利要求1或2中所述的试剂盒进行qPCR反应，按基因组DNA浓度和DNA反应扩增曲线Cq值建立标准曲线；
[0017]S6、将待测eDNA的Cq值代入所述标准曲线中进行计算，获得eDNA含量。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
[0019](1)本专利技术是一种利用陆地环境DNA来检测亚洲玉米螟的试剂盒，它能快速、准确
地检测出某种害虫，对于物种的特异性较高，且检测的结果比较精准。相对于常规的形态学的检测方法，在分子生物学层面进行检测更具有可信度和通用性；而且该方法仅需采集样品进行eDNA富集，之后进行qPCR反应，比传统的检测方式节省了很多时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒，其特征在于，包括根据目标害虫亚洲玉米螟基因组中特异性DNA设计的引物对和Taqman荧光探针；所述亚洲玉米螟基因组特异性DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物对包括YZYMM
‑
F 和 YZYMM
‑
R，所述YZYMM
ꢀ‑
F的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述YZYMM
‑
R的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；所述Taqman荧光探针的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。2.根据权利要求1所述的基于陆生环境DNA检测亚洲玉米螟的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括聚碳酸酯蚀滤膜(Φ=10
µ
m)和缓冲试剂。3.根据权利要求1所述的试剂盒在陆生环境检测亚洲玉米螟的应用。4.根据权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋凯月，张翼飞，王晓霞，彭建军，孙远东，陈芝兰，崔小娟，
申请(专利权)人：湖南科技大学，
类型：发明
国别省市：