使用鉴定病原体的RNA/DNA等温扩增的LAMP测定装置和方法制造方法及图纸

本发明专利技术涉及一种利用RNA/DNA的等温扩增来鉴定病原体的LAMP测定装置，其包括：LAMP测试室(1)；电子柜(4)、电源装置(7)；和用于关闭LAMP测定室(1)的顶盖(2)，所述装置包括：圆柱形金属干块(8)，其具有用于定位微管(81)的孔(80)；具有中央处理的控制板(14)；电子电源板(13)；至少一个加热元件(10)，其与干块(8)接触并被设计为通过感应加热干块(8)；温度传感器(9)，其被设计用于测量干块(8)的温度；多个RGB LED(12)，其定位在干块(8)下方并且被设计为激发定位在干块(8)内部的每个微管；和腔室(11)，其定位在干块(8)下方并且被设计为捕获定位在干块(8)中的每个微管(81)的图像。本发明专利技术还涉及一种用于利用LAMP测定装置鉴定病原体的方法。法。法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用鉴定病原体的RNA/DNA等温扩增的LAMP测定装置和方法


[0001]本专利技术汇集了用于疾病的快速分子诊断的装置和方法。更准确地说，其为旨在通过等温DNA/RNA扩增进行病原体检测的平台，其可用于对人类健康具有重要意义的疾病(包括COVID
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19)的诊断。其还可以重编程和/或配置用于诊断兽医疾病、健康监测或农业综合企业的重要性。

技术介绍

[0002]环介导等温DNA/RNA扩增技术，也称为LAMP(Loop
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Mediated Isothermal Amplification)，可应用于开发用于鉴定不同病原体的诊断测试。它是一种使用4到6个引物扩增核酸的技术，这些引物被设计为通过产生有助于通过DNA聚合酶合成新核酸分子的茎环结构来扩增靶标序列。LAMP技术在恒定温度(通常为60
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65℃)进行，并且由于它使用多个引物来扩增靶标序列，因此它也具有高度特异性。
[0003]LAMP技术已越来越多地用作检测分子靶标(DNA/RNA)的替代方法，因为它具有高灵敏度、特异性、反应时间减少以及不需要复杂的实验室结构来进行等温扩增反应的优点。
[0004]LAMP测定在所谓的LAMP测定室或本报告中采用的LAMP测定装置中进行，其允许通过加热装置内部的测定室来扩增样品中的遗传物质(DNA或RNA)以用于病原体检测和疾病诊断。
[0005]在这些测定中，概括地说，将试剂添加到待分析的生物样品中，并将该组在LAMP测定室中加热到给定温度，通常范围为60
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65℃。然后在测定过程中监测这些样品，其结果可以通过反应中颜色(或荧光)的变化来测量，指示阳性样品，使用可置换探针进行实时读数以构建荧光对时间曲线，并确认相关病原体的存在。
[0006]LAMP测定室的几种设置从现有技术中已知，这将在以下段落中描述。
[0007]文献CN203720089U描述了一种LAMP反应的荧光强度分析仪，其包括计算机数据处理装置、光学传感器、恒温加热板和UV光源。恒温加热板由底座和空心圆柱体组成，其中放置有由透光材料制成的反应管。圆柱体的侧壁上有孔，在一侧与外部紫外光源对准，并且在另一侧与光学传感器对准，所述光学传感器通过电缆连接到计算机数据处理装置。该传感器能够比较SYBR Green“染料”(一种DNA嵌入荧光团，其在双链分子存在的情况下发出荧光)发出的荧光的强度，作为扩增的DNA量增加的间接测量。通过这种方式，可以实时推断给定靶标(或基因)的量化。一种有用的策略例如计算样品之间的病毒载量。
[0008]Nature的文章"A smartphone
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based diagnostic platform for rapid detection of Zika,chikungunya,and dengue viruses"(Priye等人,2017)描述了用于LAMP测定的3D打印装置的开发，该装置结合基于智能手机的检测系统，可以同时诊断寨卡病毒、登革病毒和基孔肯雅病毒。盒形装置由三个主要组件组成：(i)加热模块(由与反应模块的管接触的平坦加热表面组成)；(ii)反应模块；以及(iii)检测模块(由安装在表面上的紧凑型LED和与其连接的作为激发源的多通道带式滤波器组成)和图像分析(反应中发出的荧光信号由智能手机摄像头捕获，并由特定应用程序进行分析)。这三个组件由智能手机
app通过蓝牙连接并远程控制。
[0009]文献"Simultaneous and high sensitive detection of Salmonella typhi and Salmonella paratyphi a in human clinical blood samples using an affordable and portable device"(Kaur等人,2019)提出了一种基于LAMP的用于检测人类血液样品中细菌的系统，该系统由LAMP扩增单元和检测单元组成，LAMP扩增单元由多个筒式加热器和温控介质组成。为了进行检测，将SYBR Green染料添加到样品中，并将管放置在3D打印的便携式设备中，其中存在以电子方式控制的在管上方的LED光源和与管成直角定位的光电探测器。该设备通过蓝牙与智能手机进行通信，所述智能手机使用可以显示、记录和存储每位患者详细信息的应用程序。
[0010]LAMP测定的操作化中的一些技术限制使得难以建立可重复且高效的测试。这些点之一与确保反应管内的均匀温度控制有关。在这方面，使用采用对流加热或仅与反应管的一部分表面接触的加热板的室不能在反应流体中提供令人满意的温度平衡。另一个限制因素涉及需要准确读取反应引起的颜色变化。在这方面，使用传感器代替目视检查至关重要。此外，传感器的类型及其相对于反应管的定位对测定的执行有很大影响。
[0011]除上述之外，SARS
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CoV
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2病毒(称为COVID
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19的综合症的病原体)的快速传播给全球公共卫生带来了诸多挑战。由于这种新型冠状病毒的观察到的发病率和死亡率、高传染性和感染性潜力，此外相对于其它病毒性呼吸道感染甚至其它病因的临床鉴别诊断几乎不可能，因此必须应用灵敏的鉴别诊断系统。
[0012]因此，Covid
‑
19大流行的到来给医院机构的处理带来了新的挑战。因此，有必要扩大对医院看到的疑似病例的诊断能力，无论是与患者有关，或甚至与直接接触的医护人员有关。
[0013]这些专业人员在他们的护理期间暴露于病毒，使该专业人员群体的感染风险增加，由于临床怀疑而产生一系列病假请求，其中许多没有诊断确认。这是一个与人事管理相关的严重问题，导致工作团队经常缺勤，并成为向民众提供援助的瓶颈。
[0014]自从报道了流行病的爆发，就发布了多种用于通过实时逆转录PCR(RT
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PCR)来检测SARS
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CoV
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2的方案。然而，开发利用IoT(物联网)技术的更简单、更便宜、更灵活的诊断系统变得相关且非常期望，因为目前巴西国家建立的大规模诊断能力和用户访问公共卫生系统(诸如SUS)的可用性受到严重限制。
[0015]在分子诊断中实施解决方案的主要限制是高成本、需要足够的基础设施和人员培训。由于需求量大，尽管做出了努力，但最近在巴西乃至全球范围内，无论是在公共部门还是私营部门，大规模检测SARS
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CoV
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2疑似病例都存在巨大困难。尽管有效，但RT
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PCR技术是集中提供的，没有足够的投入生产来服务于人群，导致系统根据严重程度标准优先诊断。
[0016]因此，根据引用的现有技术文件，注意到现有技术包括许多具有不同配置的LAMP测定反应和读取设备。然而，很明显，仍然可以提出许多改进，特别是关于原位进行LAMP测定的有效性，因为到目前为止还没有一种单一的LA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种应用于病原体鉴定的促进等温RNA/DNA扩增的LAMP测定装置，其特征在于，包括：LAMP测定室(1)；电子柜(4)、电源装置(7)；和用于关闭所述LAMP测定室(1)的顶盖(2)，其中所述装置在内部包括：金属圆柱形热块(8)，其包括用于定位微管(81)的开口(80)；具有中央处理的控制板(14)；电源电子板(13)；至少一个加热元件(10)，其与所述热块(8)接触并适于通过感应加热所述热块(8)；温度传感器(9)，其适于测量所述热块(8)的温度；多个RGB LED(12)，其定位在所述热块(8)下方并适于激发定位在所述热块(8)中的每个微管；和相机(11)，其定位在所述热块(8)下方并适于捕获定位在所述热块(8)中的每个微管(81)的图像。2.根据权利要求1所述的LAMP测定装置，其特征在于，所述具有中央处理的控制板(14)包括用于与移动用户设备通信并适于根据通过控制所述加热元件(10)建立的时间表并响应于来自所述温度传感器(9)的信号来控制所述热块(8)的温度的装置。3.根据权利要求1或2所述的LAMP测定装置，其特征在于，包括适于通知用户所述装置的状态的视觉操作警告元件，其中所述视觉元件是定位在所述装置外部的LED，其适于通过特定颜色指示所述装置的状况。4.根据权利要求1至3中任一项所述的LAMP测定装置，其特征在于，包括与所述中央处理控制板(14)通信的盖关闭传感器(3)，其中所述中央处理控制板(14)适于仅在所述顶盖(2)关闭时才允许所述装置运行。5.根据权利要求1至4中任一项所述的LAMP测定装置，其特征在于，在外部包括：连接到电源接入点的电源；底盖(6)；所述电子控制装置定位于其中的电子柜(4)；和开/关按钮(5)。6.根据权利要求1至5中任一项所述的LAMP测定装置，其特征在于，所述热块(8)包括圆柱形阳极化铝块，所述圆柱形阳极化铝块中的每个开口适于完全容纳0.2mL微管。7.根据权利要求1至6中任一项所述的LAMP测定装置，其特征在于，所述加热元件(10)与所述热块(8)接触并通过感应加热支撑件。8.根据权利要求1至7中任一项所述的LAMP测定装置，其特征在于，用于定位所述微管(81)的所述开口(80)成38
°
至52
°
的角度。9.根据权利要求1至8中任一项所述的LAMP测定装置，其特征在于，所述热块(8)在每个用于定位所述微管(81)的所述开口(80)的内部下部包括孔(82)，其中所述孔(82)适于允许用四个荧光信号带激发光，此外还使得可以通过所述相机(11)对每个微管进行独特成像。10.根据权利要求1至9中任一项所述的LAMP测定装置，其特征在于，所述具有中央处理的控制板(14)与所述用户设备之间的通信通过无线技术进行。11.用于由权利要求1至10中任一项所定义的LAMP测定装置鉴定病原体的方法，其特征在于，包括以下步骤：激活至少一个加热元件(10)以将所述热块(8)的温度升高到用于定义的诊断反应的预设温度；将所述热块(8)的温度在所述预设温度保持用于所述定义的诊断反应的一段预设时间，并关闭所述加热元件(10)；打开所述多个RGB LED(12)以激发定位在所述热块(8)中的每个微管；
NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54至少90％相同的序列；或(l):六个引物，每个分别具有与SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60至少90％相同的序列；或(m):(a)和(b)的组合；或(n):(c)和(d)的组合；或(o):(f)和(g)的组合；或(p):(h)和(i)的组合；或(q):(j)和(k)的组合；和(ii)检测所述生物样品中的靶标核酸扩增产物。17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于步骤(i)，所述方法是RT
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LAMP。18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于步骤(i)，所述靶标核酸是SARS
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CoV2的核酸。19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，在步骤(i)中，所述引物组包括：(a):六个引物，每个分别具有与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30至少90％相同的序列；或(b):六个引物，每个分别具有与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36至少90％相同的序列；或(c):六个引物，每个分别具有与SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42至少90％相同的序列；或(d):六个引物，每个分别具有与SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁本斯，
申请(专利权)人：奥斯瓦道，
类型：发明
国别省市：