一种探针及其检测试剂制造技术

一种探针及其检测试剂，探针包含抗生素以及荧光基团。本发明专利技术提供的探针可以特异性识别革兰阴性菌及其来源的BEVs，而对哺乳动物细胞、革兰氏阳性菌及其释放的囊泡无靶向性，提高病原体感染诊断效能。高病原体感染诊断效能。高病原体感染诊断效能。

【技术实现步骤摘要】
一种探针及其检测试剂


[0001]本专利技术涉及生物医学检测
，具体涉及一种探针及其检测试剂。

技术介绍

[0002]细菌广泛定植于人体肠道、皮肤及口腔等部位。通过与宿主的动态双向交流，细菌广泛参与到免疫调节、发育、营养代谢等生理过程。近年来，微生物组学的发展与研究提示菌群紊乱与众多疾病相关，细菌可在营养不良、肥胖症、糖尿病、阿尔兹海默病、肿瘤等多种疾病的发生发展中发挥重要作用。近年来研究提示，细菌可以通过表面抗原分子、代谢产物、分泌型毒力因子等，调控其定植组织或临近器官的微环境，从而在宿主多种生理病理进程中发挥作用。然而，其中的具体作用机制、作用途径，尤其是细菌对远处器官的调控方式仍有待进一步解答。因此，检测细菌释放的关键作用成分对揭示细菌作用宿主的具体分子机制、挖掘潜在临床诊疗新靶标具有重要价值。
[0003]细菌胞外囊泡(Bacterial Extracellular Vesicles,BEVs)是由细菌释放，直径范围在40
‑
200nm的脂质膜囊泡结构。BEVs性质稳定、循环有效时间长，并且携带了大量源于细菌母体的活性分子，被认为是细菌与细菌、细菌与宿主之间相互交流的一个重要新途径。目前越来越多研究表明，BEVs参与了宿主多种生理病理过程。值得关注的是，细菌BEVs可以穿透肠屏障进入宿主血液循环分布于不同组织器官。以上研究表明，细菌可以通过释放BEVs影响宿主生理病理功能，并且有可能以进入宿主循环的方式发挥远程调控作用，提示BEVs有望成为一类新型的疾病诊疗靶标。
[0004]细菌感染(Bacterial infections)作为全球第二大死因，其早期诊断是尽早干预、降低病死率的关键所在。目前，细菌感染的诊断在很大程度上仍依赖于细菌培养。然而，细菌培养周期长，易污染且阳性率低，严重耽误了患者的治疗时间。因此，开发新的细菌感染早期诊断指标对于细菌感染患者的早诊早治至关重要。值得关注的是，多项研究证实细菌增殖过程会释放BEVs到周围组织，提示体内BEVs与细菌感染的相关性。
[0005]生物样本中BEVs的精准检测是研究其与宿主相互作用及其应用价值的必要前提，然而从复杂生物样本中识别BEVs仍缺乏理想检测方法。目前已有的BEVs检测方法主要分为两类：一类是通过在BEVs上表达荧光蛋白实现检测，但该方法依赖于体外基因工程技术，存在改变BEVs组成成分以及功能的弊端，且目前仅限于动物模型的应用。另一类则是提取样本总的囊泡后进行测序、ELISA以及WB等方式对总囊泡进行靶点分析从而间接评估BEVs含量。然而，这类基于均相的检测方法灵敏度较低，难以有效地从含有大量复杂成分的宿主样本中识别极少量的BEVs。此外，上述方法均通过对样本中相关靶标总量的测定，无法区分靶标来自于BEVs还是其他细菌成分，导致检测结果容易受样本中细菌碎片及游离成分的干扰。综上，BEVs的检测仍缺乏理想手段，其准确定量分析面临以下挑战：首先，目前仍缺乏对BEVs特异且普适的生物标志物。生物样本中BEVs混杂于大量宿主细胞释放的囊泡中，它们皆为脂质双分子层结构且大小、形态相似，亟需BEVs的特异性区分手段。其次，BEVs准确定量需要高精度的检测平台。生物样本中成分复杂且BEVs含量极少，这对BEVs的检测技术的
灵敏度具有极高的要求。囿于上述挑战，目前大部分BEVs的研究均利用体外培养细菌进行，而BEVs在宿主样本中的含量以及动态变化规律仍不清晰，从而阻碍了BEVs在宿主的功能研究以及其在疾病中的临床转化。

技术实现思路

[0006]根据第一方面，在一实施例中，提供一种抗生素荧光探针，包含抗生素以及荧光基团。
[0007]根据第二方面，提供一种检测试剂，包含第一方面的抗生素荧光探针。
[0008]根据第三方面，在一实施例中，提供囊泡作为标记物在制备病原体感染检测试剂中的用途。
[0009]根据第四方面，在一实施例中，提供一种检测方法，包括：
[0010]标记步骤，使用第一方面任意一项的抗生素荧光探针标记样本中的囊泡；
[0011]检测步骤，根据样本中荧光阳性的颗粒数占比，预测样本所属生物体是否感染细菌。
[0012]根据第五方面，在一实施例中，提供一种检测装置，包括：
[0013]标记模块，用于使用第一方面任意一项的抗生素荧光探针标记样本中的囊泡；
[0014]检测模块，用于根据样本中荧光阳性的颗粒数占比，预测样本所属生物体是否感染细菌。
[0015]在一实施例中，本专利技术提供的探针可以特异性识别革兰阴性菌及其来源的BEVs，而对哺乳动物细胞、革兰氏阳性菌及其释放的囊泡无靶向性，提高病原体感染诊断效能。
附图说明
[0016]图1为一种实施例的抗生素荧光探针结构示意图。
[0017]图2中，(a).不同革兰阴性菌、革兰阳性菌及哺乳动物细胞与抗生素荧光探针共孵育后超分辨显微镜成像图；(b).不同革兰阴性菌、革兰阳性菌及哺乳动物细胞与抗生素荧光探针共孵育后cytation5荧光定量结果。
[0018]图3中，(a).抗生素荧光探针标记后大肠杆菌BEVs超分辨显微镜图像；(b).纳米流式检测仪用于BEVs定量分析示意图；(c).抗生素荧光探针标记后不同源性囊泡纳米流式检测仪定量分析结果。
[0019]图4中，(a).抗生素荧光探针标记前后BEVs粒径和形态没有显著性差异(比例尺：100nm)。(b,c,d).抗生素荧光探针标记后7天内BEVs粒径、浓度及荧光强度变化情况；(e).抗生素荧光探针标记前后BEV考马斯亮蓝成分表征；(f).抗生素荧光探针标记前后BEVs细胞毒性；(g,h).抗生素荧光探针标记前后BEVs细胞划痕实验结果。
[0020]图5中，(a,b).健康体检人群、细菌感染以及血流感染患者循环BEVs水平检测结果；(c).循环BEVs联合CRP,PCT指标用于细菌感染诊断的AUC曲线。
[0021]图6中，(a).小鼠细菌感染模型构建示意图；(b).小鼠细菌感染模型血液细菌培养结果；(c).小鼠细菌感染模型循环BEVs变化定量分析，在细菌感染后6、12、24小时，小鼠循环BEVs水平均有不同程度的升高；(d).小鼠细菌感染模型细菌培养及循环BEV检出率对比结果。
具体实施方式
[0022]下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
[0023]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗生素荧光探针，其特征在于，包含抗生素以及荧光基团。2.如权利要求1所述的抗生素荧光探针，其特征在于，所述抗生素用于特异性靶向结合至病原体和/或其胞外囊泡；或，所述病原体包括微生物；或，所述微生物包括细菌、真菌中的至少一种；或，所述抗生素包括多肽类抗生素；或，所述多肽类抗生素包括多粘菌素B。3.如权利要求1所述的抗生素荧光探针，其特征在于，所述抗生素荧光探针包含如下结构式：
式(1)～(4)中，R包括荧光基团；或，所述荧光基团包括异硫氰酸荧光素。4.如权利要求1所述的抗生素荧光探针，其特征在于，所述探针用于标记样本中的囊泡；或，所述囊泡包括胞外囊泡；或，所述胞外囊泡包括细菌胞外囊泡；或，所述样本包括体液样本。5.一种检测试剂，其特征在于，包含如权利要求1至4中任意一项所述的抗生素荧光探针。6.如权利要求5所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包含辅助试...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑磊，李迁贝，司徒博，欧子豪，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：