基于亚氨基硼酸酯结构的可电离阳离子类脂及其制备方法技术

本发明专利技术提供了基于亚氨基硼酸酯结构的可电离类脂及其制备方法与其在治疗小鼠脉络膜新生血管中的应用，具有高效mRNA递送能力；该类脂通过“Ax+By+Cz”一锅法合成，该结构具有微酸和ROS双重敏感性，尤其是类脂lipidoid

【技术实现步骤摘要】
基于亚氨基硼酸酯结构的可电离阳离子类脂及其制备方法


[0001]本专利技术涉及脂质体制备以及基因负载和递送领域，具体涉及具有高效mRNA递送能力的基于亚氨基硼酸酯结构可电离阳离子类脂的制备方法，并应用于小鼠脉络膜新生血管治疗。

技术介绍

[0002]湿性老年性黄斑变性（wAMD）是一种眼部新生血管疾病。由于新生血管较正常血管脆弱且不规则，更容易破裂，导致反复渗出、出血。光动力治疗是其主要临床治疗方法，但可能对正常眼部组织造成危害。近年来血管内皮生长因子A(VEGFA)的过表达已被确定为血管生成的主要原因之一，因此，各种VEGFA抑制剂已被批准用于湿性黄斑变性的治疗，例如贝伐单抗、雷珠单抗、苏尼替尼等。然而频繁注射甚至终生注射会造成患者严重的经济负担和毁灭性的眼部并发症。为了达到“一劳永逸”的治疗效果，腺相关病毒(AAV)介导的CRISPR/Cas9基因组编辑系统在wAMD小鼠模型中预防脉络膜新生血管（CNV）取得了成效。但AAV的免疫原性和Cas9长期表达所引起的安全性问题不容忽视。
[0003]近年来，基于非病毒的CRISPR/Cas9载体得到发展。脂质体纳米颗粒(Lipid nanoparticles，LNPs)因其转染效率高，细胞毒性低，且免疫原性可忽略不计等优势而成为应用最广泛的非病毒载体。科学家开发了几种用于CRISPR/Cas9递送LNPs用于治疗遗传性疾病和非遗传性疾病。据报道，通过lipofectamine 2000 (LPF 2K) 包载Cas9和sgVEGFA复合物（RNP）后，通过单次视网膜下注射可以敲除RPE细胞中的VEGFA基因，减少CNV面积。然而，这需要高剂量的RNP, 此外LPF 2K的高细胞毒性不可忽视。因此，开发具有侵入性小且具有高基因组编辑效率和低细胞毒性基于的LNP的CRISPR/Cas9传递系统对湿性黄斑变性的治疗具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种基于亚氨基硼酸酯结构的可电离阳离子类脂；以该类脂和辅助脂质组装的脂质体可以有效包载mRNA分子，利用细胞内的高浓度ROS以及溶酶体的微酸性环境触发类脂结构降解，促进核酸分子的胞内释放。此外其具有良好的生物相容性、稳定性。并提供上述基于亚氨基硼酸酯结构可电离阳离子类脂的制备方法和在小鼠脉络膜新生血管治疗中的应用。
[0005]本专利技术提供一种基于亚氨基硼酸酯结构的可电离阳离子类脂，通过“Ax + By + Cz”一锅法合成，随后与辅助脂质（胆固醇、DOPE、DMG
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PEG2000）以及mRNA分子通过静电自组装的方式形成脂质体/mRNA复合物。本专利技术的可电离类脂具有ROS和酸双重响应性，其分子中具有亚胺键以及硼酸酯结构。
[0006]本专利技术采用如下技术方案：一种基于亚氨基硼酸酯结构的可电离类脂，具有式（I）所示的结构：
。
[0007]所述式（I）所示的结构中，R1为具有不同碳原子的烷基链或其他疏水结构，R2为具有不同结构的含胺分子。
[0008]本专利技术提供了上述具有式（Ⅰ）结构的可电离类脂的制备方法，包括以下步骤：以单体A、单体B、单体C为原料，反应制备基于亚氨基硼酸酯结构的可电离阳离子类脂。优选的，单体A、单体B、单体C的摩尔比为1～2∶1∶1，优选的摩尔比为1∶1∶1。单体A、单体B和单体C在甲醇和氯仿的混合溶剂中、室温下反应1～10小时，优选的，单体A、单体B和单体C以摩尔比1∶1∶1在甲醇和氯仿的混合溶剂（甲醇/氯仿 = 1/10, V/V）反应6～8 h。
[0009]本专利技术中，单体A为具有伯胺、仲胺或者叔胺结构的可电离含氨基类化合物，具体结构如下：式中：R2表示带有伯胺、仲胺或者叔胺等可电离结构的基团。
[0010]本专利技术中，单体B为2
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甲酰基苯硼酸、3
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甲酰基苯硼酸和4
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甲酰基苯硼酸的其中一种，其具体结构如下：
[0011]本专利技术中，单体C的结构可用下式表示：
[0012]式中：R1表示具有不同碳链长度的烷基链或者其他疏水链。
[0013]作为具体的例子，单体A为下式所示的结构之一：
[0014]单体B为下式所示的结构之一：
[0015]单体C为下式所示的结构之一：
[0016]本专利技术公开了一种纳米药物的制备方法，包括以下步骤：以单体A、单体B、单体C为原料，反应制备基于亚氨基硼酸酯结构的可电离阳离子类脂；所述可电离阳离子类脂与辅助脂质和药物自组装得到纳米药物；具体的，将可电离类脂和辅助脂质（胆固醇、DOPE、DMG
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PEG）溶解于无水乙醇中，再加入核酸的水溶液，使用移液枪将两相混合，然后于室温下孵育30 min，随后在PBS中透析得到纳米药物。
[0017]本专利技术中，单体A、单体B和单体C溶解于甲醇/氯仿的混合溶剂中，室温反应，制备基于亚氨基硼酸酯结构可电离阳离子类脂；甲醇和氯仿的体积比为1:10，反应时间为6 h。
[0018]本专利技术中，以丙烯酸酯和2
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氨基
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1,3
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丙二醇为原料，制备单体C。优选的，在70～100℃密封条件下，以丙烯酸酯和2
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氨基
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1,3
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丙二醇为原料，在反应溶剂中制备单体C。
[0019]具体的，本专利技术具有式（Ⅰ）结构的化合物类脂的制备方法如下：
（1）以丙烯酸酯和2
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氨基
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1,3
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丙二醇为原料，反应制备单体C；（2）以单体A、单体B和单体C为原料，反应制备基于亚氨基硼酸酯的可电离阳离子类脂。
[0020]上述技术方案中： 步骤（1）中，以甲苯为反应溶剂，反应条件为90℃密封下反应48 h；步骤（2）中，以甲醇和氯仿的混合溶剂为反应溶剂，室温反应6 h。
[0021]上述具体反应可表示如下：
[0022]本专利技术公开了上述基于亚氨基硼酸酯结构的可电离类脂在制备药物中的应用，或者在制备药物载体中的应用。上述纳米药物在制备mRNA递送或者基因编辑药物中的应用。
[0023]本专利技术中，所述药物为mRNA，比如，所述mRNA编码荧光素酶或者绿色荧光蛋白或者Cas9蛋白。优选的，所述基于亚氨基硼酸酯结构的可电离类脂与mRNA的氮磷比为（1～50）∶1，优选为（4～10）∶1，进一步优选为（6～8）∶1。
[0024]本专利技术提供的基于亚氨基硼酸酯结构可电离阳离子类脂可以与辅助脂质及核酸自组装形成纳米药物，因此本专利技术公开了一种纳米药物，由上述亚氨基硼酸酯结构类脂与辅助脂质复合药物得到。
[0025]本专利技术中，所述纳米药物的粒径为100～200 nm，优选的粒径为100～150 nm，更优选的粒径为110～150 nm。所述纳米药物的Zeta电势为2～4 mV。
[0026]本专利技术中，所述辅助脂质为胆固醇、1,2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于亚氨基硼酸酯结构的可电离类脂，其特征在于：所述基于亚氨基硼酸酯结构的可电离类脂具有式（I）所示的结构：所述式（I）所示的结构中，R1为具有不同碳链长度的烷基链或其他疏水结构，R2为含胺分子。2.权利要求1所述基于亚氨基硼酸酯结构的可电离类脂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以单体A、单体B、单体C为原料，反应制备基于亚氨基硼酸酯结构的可电离类脂。3.根据权利要求2所述基于亚氨基硼酸酯结构的可电离类脂的制备方法，其特征在于，单体A为具有伯胺、仲胺或者叔胺结构的可电离含氨基类化合物；单体B为2
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甲酰基苯硼酸、3
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甲酰基苯硼酸、4
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甲酰基苯硼酸的中一种；以丙烯酸酯和2
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氨基
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1,3
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丙二醇为原料，制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷黎晨，曹德盛，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：