烟草NtREV基因的编辑方法、gRNA、质粒、试剂盒及其应用技术

本申请涉及烟草NtREV基因技术领域，具体涉及烟草NtREV基因的编辑方法、gRNA、质粒、试剂盒及其应用。该gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。该质粒携带该gRNA对应的脱氧核苷酸序列以及Cas9的编码基因。该试剂盒包括该gRNA或包括该质粒。利用这些gRNA、质粒或试剂盒能够获得了烟草双拷贝NtREV基因的纯合突变植株，该烟草植株的植株顶端分生组织缺失，从而植株呈现出顶芽缺失的表型。而植株呈现出顶芽缺失的表型。而植株呈现出顶芽缺失的表型。

【技术实现步骤摘要】
烟草NtREV基因的编辑方法、gRNA、质粒、试剂盒及其应用


[0001]本申请涉及烟草NtREV基因
，具体涉及烟草NtREV基因的编辑方法、gRNA、质粒、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]栽培烟草为异源四倍体特种经济作物，相比较于拟南芥REV，栽培烟草中REV存在两个拷贝(NtREV1，Nitab4.5_0004624g0050.1和NtREV2，Nitab4.5_0003131g0030.1)。对烟草NtREV编码的蛋白进行结果分析发现，其蛋白具有4个保守结构域，HD结构域、Zip结构域、START和MEKHLA结构域，HD和Zip结构域比较保守，参与调控靶基因的表达，而START和MEKHLA结构域在动物研究中较多，参与了外界信号接收与传递。由于烟草的NtREV基因存在双拷贝，往往需要对双拷贝的基因进行同时编辑才能得到其经编辑的纯合子，并依据这些纯合子进行功能分析才能准确得到该基因在烟草中的相关生物学功能。

技术实现思路

[0003]本申请专利技术人创造性地以烟草NtREV基因的第一外显子作为编辑靶点区域进行基因编辑，获得了烟草双拷贝NtREV基因的纯合突变植株。对该烟草的纯合突变植株通过体式显微镜和扫描电子显微镜观测，结果表明该纯合突变植株顶端分生组织缺失，从而植株呈现出顶芽缺失的表型，为得到顶芽缺失的烟草植株材料提供了帮助。
[0004]为此，本申请至少公开了如下技术方案：
[0005](1)编辑烟草NtREV基因的gRNA，其中，所述gRNA靶向所述烟草NtREV基因的第一外显子，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示，所述烟草NtREV基因编号为Nitab4.5_0004624g0050.1和/或Nitab4.5_0003131g0030.1。
[0006](2)编辑烟草NtREV基因的引物对，其中，所述引物对包括具有如SEQ ID NO.6～7所示核苷酸序列的DNA分子，或者具有如SEQ ID NO.8～9所示核苷酸序列的DNA分子。
[0007](3)编辑烟草NtREV基因的基因编辑质粒，其中，所述基因编辑质粒包含(1)所述的烟草NtREV基因的gRNA和Cas9的编辑基因。
[0008](4)烟草NtREV基因的基因编辑试剂盒，包括(2)所述的引物对；携带基础gRNA对应脱氧核苷酸序列的第一质粒；以及携带编码cas9编辑基因的第二质粒。
[0009](5)编辑烟草NtREV基因的试剂盒，包括(3)所述的基因编辑质粒以及维持所述基因编辑质粒转化活性的试剂；其中，
[0010]所述基因编辑质粒携带有编辑烟草NtREV基因的gRNA，所述gRNA靶向所述烟草NtREV基因的第一外显子，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示，所述烟草NtREV基因编号为Nitab4.5_0004624g0050.1和/或Nitab4.5_0003131g0030.1。
[0011](6)一种宿主细胞，所述宿主细胞携带有(1)所述的gRNA、(3)所述的基因编辑质粒。
[0012](7)烟草NtREV基因的基因编辑质粒的构建方法，包括：
[0013]获得第一质粒并合成引物对，所述第一质粒携带如SEQ ID NO.8所示的基础gRNA对应的脱氧核苷酸序列，所述引物对依据所述基础gRNA对应的脱氧核苷酸序列设计获得，所述gRNA的靶序列位于所述烟草NtREV基因的第一外显子；
[0014]利用引物对和第一质粒得到携带gRNA对应脱氧核苷酸序列的重组质粒；
[0015]对携带gRNA对应脱氧核苷酸序列的重组质粒进行酶切得到gRNA对应的DNA分子，与酶切的携带Cas酶编码基因的第二质粒序列进行连接，得到所述基因编辑质粒。
[0016](8)一种烟草NtREV基因的编辑方法，包括：
[0017]获得烟草NtREV基因的gRNA，所述gRNA的靶序列位于所述烟草NtREV基因的第一外显子，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示，所述烟草NtREV基因编号为Nitab4.5_0004624g0050.1和/或Nitab4.5_0003131g0030.1；
[0018]利用所述gRNA构建编辑烟草NtREV基因的基因编辑质粒；
[0019]将所述基因编辑质粒转入农杆菌中；
[0020]将转入了所述基因编辑质粒的农杆菌浸染烟草。
[0021](9)如(1)所述的gRNA、或如(2)所述的引物对、或如(3)所述的基因编辑质粒、或如(4)所述的试剂盒在烟草NtREV基因编辑中的应用。
[0022]本申请实施例提供的烟草NtREV基因的编辑方法、gRNA、质粒、试剂盒及其应用具有的技术效果在具体实施例方式中具体阐明。
附图说明
[0023]图1为本申请实施例提供的烟草NtREV基因的基因编辑质粒的构建流程示意图。
[0024]图2为本申请实施例提供的基因编辑质粒的PCR扩增检测(A)和双酶切核酸电泳(B)结果图。
[0025]图3为本申请实施例提供的烟草NtREV基因第一外显子的C15和C16位置分别进行编辑得到的菌株的PCR鉴定电泳结果图。M泳道为DL2000 DNAMarker。
[0026]图4为本申请实施例提供的经过烟草NtREV基因编辑得到的各菌株与双拷贝基因的第一外显子的第一位置C16(左图)和第二位置C15(右图)位置的序列比对结果图。图中，下划线代表碱基替换，
“‑”
表示缺失的碱基，小写字面代表碱基插入。
[0027]左图中，“Reference”代表野生烟草NtREV基因第一位置的核苷酸序列；“Allele1”代表烟草NtREV基因突变株等位基因对应的第一位置的核苷酸序列；“Allele2”代表烟草NtREV基因突变株对应等位基因第一位置的核苷酸序列。
[0028]右图中，“Reference”代表代表野生烟草NtREV基因第二位置的核苷酸序列；“Allele1”代表烟草NtREV基因突变株等位基因对应的第二位置的核苷酸序列；“Allele2”代表烟草NtREV基因突变株对应等位基因第二位置的核苷酸序列。
[0029]图5为本申请实施例提供的经基因编辑的烟草NtREV植株以及野生型植株的幼苗形态。A
‑
F为烟草双拷贝同源突变体的叶发育形态；包括漏斗形叶、荷叶形叶等形态；G
‑
H：烟草单拷贝同源突变体叶发育形态；I：对应时期野生型烟草生长状态；标尺：1cm。
[0030]图6为烟草双拷贝同源突变体(Ko
‑
C15Ntrev)和单拷贝同源突变体(Ko
‑
C16Ntrev)的NtREV突变体观测表型。
[0031]图7为本申请实施例提供的经基因编辑的烟草NtREV植株以及野生型植株的顶芽
光镜及实物观测图。标尺：500μm/200μm。图7A、7D、7G依次本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.编辑烟草NtREV基因的gRNA，其中，所述gRNA靶向所述烟草NtREV基因的第一外显子，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示，所述烟草NtREV基因编号为Nitab4.5_0004624g0050.1和/或Nitab4.5_0003131g0030.1。2.编辑烟草NtREV基因的引物对，其中，所述引物对包括具有如SEQ ID NO.6～7所示核苷酸序列的DNA分子，或者具有如SEQ ID NO.8～9所示核苷酸序列的DNA分子。3.编辑烟草NtREV基因的基因编辑质粒，其中，所述基因编辑质粒包含如权利要求1所述的烟草NtREV基因的gRNA和Cas9的编辑基因。4.烟草NtREV基因的基因编辑试剂盒，其特征在于，包括：如权利要求2所述的引物对；携带基础gRNA对应脱氧核苷酸序列的第一质粒；以及携带编码cas9编辑基因的第二质粒。5.编辑烟草NtREV基因的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求3所述的基因编辑质粒以及维持所述基因编辑质粒转化活性的试剂；其中，所述基因编辑质粒携带有编辑烟草NtREV基因的gRNA，所述gRNA靶向所述烟草NtREV基因的第一外显子，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示，所述烟草NtREV基因编号为Nitab4.5_0004624g0050.1和/或Nitab4.5_0003131g0030.1。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：余婧，雷波，赵会纳，王兵，陈杰，夏海乾，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：