基因沉默的介体制造技术

本发明专利技术涉及抑制生物系统中基因的表达的方法。本发明专利技术的方法包括将tRNA衍生的多核苷酸引入生物系统中。本发明专利技术的tRNA衍生的多核苷酸包含与其表达被抑制的基因的内含子区域或外显子区域互补的序列。显子区域互补的序列。显子区域互补的序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因沉默的介体


[0001]本专利技术涉及抑制生物系统中基因表达的方法。本专利技术进一步涉及tRNA衍生的多核苷酸及其作为药物的用途。

技术介绍

[0002]哺乳动物细胞利用源自各种内源性来源的小RNA(sRNA)在称为RNA干扰(RNAi)的途径中调节基因表达。这些sRNA包括微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)，它们可以在细胞质中调节许多转录后蛋白质编码基因的表达。
[0003]RNAi途径存在于许多真核生物中并由Dicer(切酶)启动，它将长的双链RNA(dsRNA)切割成更短的双链片段，其长度约为21个核苷酸。这些短的双链片段被称为siRNA。每个siRNA解开形成两条单链RNA，其中一条(引导链)被掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。然后引导链与互补信使RNA(mRNA)配对，并由RISC的催化成分Argonaute 2(Ago2)诱导切割，导致转录后基因沉默。
[0004]miRNA是参与基因表达调控的非编码RNA，尤其是在发育过程中。如上所述，RNAi包括miRNA的基因沉默效应以及由dsRNA触发的基因沉默效应。miRNA，一旦被Drosha加工，就会被Dicer结合和切割，产生可以被掺入RISC中的miRNA。然而，与载有siRNA的RISC不同，载有miRNA的RISC会扫描mRNA以寻找潜在的互补序列，并结合这些mRNA的3'非翻译区，从而阻止翻译。
[0005]围绕RNAi的潜在机制的理解的进展已在许多领域得到利用，包括研究，例如基因功能的研究，以及用于疾病的治疗的各种治疗应用。与一种或多种基因活性相关的疾病应该非常适合基于RNAi的疗法，因为可以设计针对这些基因的小RNA并将其用作治疗剂。例如，这些可能包括癌症、自身免疫性疾病和神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病。RNAi的临床应用已用于治疗与年龄相关的黄斑变性，并且正在一系列治疗领域开发进一步的疗法，包括各种病毒感染，例如HIV的治疗。开发可用于疾病的治疗的抑制基因表达的方法将是有利的。
[0006]转移RNA(tRNA)是长度在大约75
‑
90个核苷酸之间的RNA分子，其作为衔接分子将氨基酸运载到mRNA的密码子。tRNA通常采用三叶草结构，其包括结合氨基酸的受体茎和与mRNA密码子互补的反密码子臂。除了它们作为衔接分子的作用外，tRNA最近还被确定为具有未表征作用的新型调节RNA片段的来源。
[0007]本专利技术的一个目的是提供抑制基因表达的新分子和方法。
[0008]专利技术概述
[0009]本专利技术涉及介导RNA干扰，特别是基因沉默的新方法。RNAi是一种生物过程，其中RNA分子通过中和靶向mRNA分子来抑制基因表达或翻译。因此，还提供了用于抑制基因表达的方法。我们还提供了一种新型的分离的tRNA多核苷酸，其介导基因沉默及其在治疗疾病的方法中的用途。
[0010]本专利技术部分基于专利技术人的研究，专利技术人在研究中表明，用tRNA衍生的多核苷酸，特
别是介导基因沉默的tRNA短片段转染细胞后，可以降低特定基因的mRNA水平和随后的蛋白质水平。这些tRNA的短片段被称为tsRNA(tRNA衍生的sRNA)。tsRNA不同于tRNA半体(half)和tRNA片段，它们都是tRNA三叶草叶结构的切割产物。然而，如本文所解释的，tsRNA是通过对交替折叠的tRNA(即茎环/发夹结构)的Dicer依赖性切割产生的。与siRNA不同，tsRNA是通过发夹样tRNA的Dicer切割在细胞核中产生的。tsRNA靶向细胞核中的基因。因此，本专利技术不涉及通过切割tRNA三叶草叶结构产生的tRNA半体和tRNA片段。
[0011]专利技术人已经表明，内切核糖核酸酶Dicer是规范的RNAi中的关键参与者，它与活跃转录的tRNA基因缔合，结合折叠成非规范二级结构的tRNA，并将它们加工成tsRNA。具体而言，专利技术人已经证明，tsRNA靶向转录靶基因的内含子和外显子，这导致新生RNA沉默(NRS)。因此，这些Dicer依赖性tsRNA具有功能性，并特异性靶向许多蛋白质编码基因的内含子，导致其新生RNA以Argonaute 2(Ago2)依赖性的方式降解。这些Dicer依赖性tsRNA还可以靶向外显子，即基因的蛋白质编码部分或lncRNA部分，并导致其新生RNA以Argonaute 2(Ago2)依赖性方式降解。这将该机制与已知siRNA介导的其他RNA机制区分开来。此外，tsRNA在细胞核中起作用，而其他已知的siRNA在细胞质中起作用。靶向基因或长链非编码RNA的内含子或外显子会导致RNA在细胞核中一产生就立即降解。专利技术人已经表明，tsRNA不是从成熟的tRNA中产生的，而是从折叠成替代二级结构的不同tRNA群体产生的，该结构可以描述为茎环/发夹结构。这些交替折叠的tRNA被Dicer识别并在细胞核中加工成tsRNA。因此，我们提出了一种依赖于Dicer的基因表达调控的新机制，该机制由tsRNA通过新生RNA降解介导，并且有别于众所周知的转录后或转录基因沉默。
[0012]重要的是，专利技术人已经表明，tsRNA靶基因与各种疾病显著相关，例如癌症，这证实了该途径的生物学重要性。因此，本文所述的tsRNA可用于疾病的治疗。
[0013]本专利技术的专利技术人已经发现，通过将tRNA衍生的多核苷酸(例如tsRNA)引入生物系统(例如细胞)中，基因或长链非编码RNA的表达可以被抑制，前提是tRNA衍生的多核苷酸包含与基因的内含子区域或外显子区域部分或完全互补的序列。本专利技术人使用该方法实现的基因表达抑制已被证明是非常有效的。
[0014]不希望受限于理论，专利技术人的理解是tsRNA通过靶向蛋白质编码基因的内含子或外显子来共转录地调节细胞核中的基因表达，用于新生RNA降解而不需要转录抑制和异染色质形成。
[0015]详细说明
[0016]现在将进一步描述本专利技术的实施方案。在以下段落中，描述了不同的实施方案。除非有相反的明确指示，否则如此定义的每个方面都可以与任何其他一个或多个方面组合。特别地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他一个或多个特征组合。
[0017]通常，与本文所述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关使用的命名法和技术是本领域熟知和常用的那些。除非另有说明，否则本公开的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法进行，并且如在整个本申请说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的那样。参见，例如，Green和Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2012)。
[0018]多核苷酸
[0019]在本专利技术的第一方面，提供了一种分离的tRNA衍生的多核苷酸，其包含与靶基因或长本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的tRNA衍生的多核苷酸，其包含与靶基因或长链非编码RNA的外显子区域互补的序列，其中所述tRNA衍生的多核苷酸是具有14至35个核苷酸的tRNA衍生的多核苷酸片段(tsRNA)。2.根据权利要求1所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述tsRNA是双链或单链的。3.根据权利要求2所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述双链tsRNA是平末端的。4.根据权利要求3所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述双链tsRNA包含突出端。5.根据前述权利要求中任一项所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中tRNA衍生的多核苷酸被化学修饰。6.根据权利要求1所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述多核苷酸是tRNA。7.根据权利要求6所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述tRNA包含茎环/发夹结构。8.根据前述权利要求中任一项所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述多核苷酸结合靶基因的mRNA的外显子区域从而抑制基因表达。9.根据前述权利要求任一项所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与所述靶基因的外显子区域至少50％、60％、70％、80％、90％或95％互补的序列。10.根据前述权利要求中任一项所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述靶基因与病理状况相关。11.根据权利要求10所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述病理状况选自癌症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、代谢性疾病、呼吸系统疾病和心血管疾病。12.根据前述权利要求中任一项所述的分离的tRNA衍生的多核苷酸，其中所述tRNA和所述tsRNA位于细胞核内。13.载体，其包含根据权利要求1至12中任一项的分离的tRNA片段。14.宿主细胞，其包含根据权利要求1至12中任一项的分离的tRNA片段或权利要求13所述的载体。15.抑制生物系统中靶基因或长链非编码RNA的表达的方法，所述方法包括：将根据权利要求1至12中任一项的tRNA衍生的多核苷酸或根据权利要求13的载体引入生物系统中。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物系统选自真核细胞，例如哺乳动物细胞或植物细胞。17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述方法还包括将酶引入生物系统中，所述酶切割tRNA以产生tsRNA。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述酶是Dicer。19.根据前述权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将tRNA衍生的多核苷酸引入细胞的细胞核中。20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将酶引入生物系统中，其将tRNA衍生的多核苷酸转运至细胞核。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述酶包括Argonaute 2(Ago2)。22.根据权利要求15至21中任一项所述的方法，其中所述方法是体外或离体方法。23.药物组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项的tRNA衍生的多核苷酸或例如根据权利要求13的载体或已经用tsRNA调节的用于修饰的细胞疗法的载体以及药学上可接受的运载体。24.根据权利要求1至12中任一项的tRNA衍生的多核苷酸或根据权利要求23的药物组合物，用作药物。25.根据权利要求1至12中任一项的tRNA衍生的多核苷酸或根据权利要求23的药物组合物，用于治疗可通过抑制靶基因的表达而改善的疾病。26.根据权利要求24或25的用途的tRNA衍生的多核苷酸或药物组合物，其中所述疾病选自癌症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病、代谢性疾病、呼吸系统疾病和心血管疾病。27.根据权利要求27所述的用途的tRNA衍生的多核苷酸或药物组合物，其中所述疾病选自癌症并且所述tRNA衍生的多核苷酸与第二疗法...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫尼卡，
申请(专利权)人：癌症研究科技有限公司，
类型：发明
国别省市：