卤代烷烃脱卤酶及其在1,2,3-三氯丙烷降解中的应用制造技术

本发明专利技术公开了卤代烷烃脱卤酶及其在1,2,3

【技术实现步骤摘要】
卤代烷烃脱卤酶及其在1,2,3
‑
三氯丙烷降解中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
中，卤代烷烃脱卤酶及其在1,2,3
‑
三氯丙烷降解中的应用。

技术介绍

[0002]1,2,3
‑
三氯丙烷是一种人工合成的有机污染物，同时也是全球范围内重要的化工产品和化工原料。由于1,2,3
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三氯丙烷具有较低的有机碳分配系数、中等溶解度和强稳定性，一旦释放便可由土壤快速迁移至地下水中，导致持久的地下水污染。1,2,3
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三氯丙烷具有致畸、致癌、致突变等高毒性作用，且对人体的毒性显著高于其他氯化物，即使低浓度的1,2,3
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三氯丙烷暴露对生态环境和人体健康也会造成巨大威胁。因此，地下水中1,2,3
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三氯丙烷的防控和治理具有重要的科学和社会意义，急需开展相关的研究工作。
[0003]微生物修复因具有绿色、经济、无二次污染、适用于大面积污染修复等优势，是治理1,2,3
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三氯丙烷污染地下水的理想手段。在厌氧和有氧条件下均可以观察到1,2,3
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三氯丙烷的生物降解，但在自然环境中的微生物降解却极为缓慢，并且主要是共代谢引起的降解。目前仅有几株菌株可以在绝对厌氧条件下利用1,2,3
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三氯丙烷作为电子受体将之转化为不稳定的氯丙烯，进而发生生物水解生成丙烯醇。但生物还原脱氯仅适用于低浓度1,2,3
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三氯丙烷(<1mg/L)污染地下水的治理，且需要较长的适应期才能启动生物降解。目前还没有以1,2,3
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三氯丙烷作为唯一碳源和能源进行生长代谢的好氧微生物被报道。这可能是由于1,2,3
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三氯丙烷对微生物的生长和代谢都具有强烈的抑制作用，或者是微生物体内缺乏1,2,3
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三氯丙烷分解代谢途径中执行某个关键步骤的酶类。
[0004]脱卤反应是1,2,3
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三氯丙烷矿化的起始步骤和关键步骤，而且脱卤反应会降低1,2,3
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三氯丙烷的生物毒性。1,2,3
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三氯丙烷在卤代烷烃脱卤酶(DhaA)的作用下首先水解脱卤生成2,3
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二氯丙醇(DCP)，之后在卤醇脱卤酶(HheC)和环氧水解酶(EchA)的作用下，最终反应生成甘油。对1,2,3
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三氯丙烷合成代谢途径中的产物分析发现，其起始的脱卤产物2,3
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二氯丙醇是一种生物可利用物质，这表明1,2,3
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三氯丙烷最初脱卤为2,3
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二氯丙醇的过程是限制1,2,3
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三氯丙烷生物降解的关键步骤。利用卤代烷烃脱卤酶直接作用于1,2,3
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三氯丙烷，不仅可以快速启动1,2,3
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三氯丙烷的生物降解，还可以降低1,2,3
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三氯丙烷对微生物的细胞毒性。因此，提高1,2,3
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三氯丙烷生物降解效率的关键是获得高活性的卤代烷脱卤酶。由于野生菌株受到多种因素的调控，产酶量往往难以达到较高的水平，限制了卤代烷烃脱卤酶的工业化应用。因此，通过基因工程技术克隆卤代烷烃脱卤酶的编码基因，并使这些基因在异源受体上大量表达具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是如何降解1,2,3
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三氯丙烷以及如何修复污染。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了降解1,2,3
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三氯丙烷的方法，所述方法包括：向含有1,2,3
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三氯丙烷的无机盐溶液中添加蛋白质进行反应，实现1,2,3
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三氯丙烷
的降解；
[0007]所述蛋白质为如下A1)或A2)：
[0008]A1)氨基酸序列是SEQ ID NO.1的蛋白质；
[0009]A2)在A1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0010]为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
[0011]表：标签的序列
[0012]标签残基序列Poly
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Arg5
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6(通常为5个)RRRRRPoly
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His2
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10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep
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tag II8WSHPQFEKc
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myc10EQKLISEEDL
[0013]上述方法中，所述无机盐溶液可由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为Na2HPO4·
7H2O 7g/L，KH2PO
4 3g/L，(NH4)2SO
4 5g/L，NaCl 3g/L，MgSO4·
7H2O 0.7g/L，利用NaOH调节pH至7.5。
[0014]上述方法中，所述反应的温度可为25
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45℃。
[0015]所述蛋白质在降解1,2,3
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三氯丙烷中的应用，也属于本专利技术的保护范围。
[0016]上述应用中，所述降解条件可为高温环境，或碱性环境，或酸性环境，或高温碱性环境，或高温酸性环境。
[0017]上述应用中，所述蛋白质降解1,2,3
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三氯丙烷的温度可为25
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60℃。进一步，所述温度可为30
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60℃。进一步，所述温度可为35
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55℃。进一步，所述温度可为40
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50℃。更进一步，所述温度可为45℃。
[0018]上述应用中，所述酸性环境可为pH 3
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6。进一步，所述酸性环境可为pH5。所述碱性环境可为pH 7
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9。进一步，所述碱性环境可为pH 8。
[0019]所述蛋白质在1,2,3
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三氯丙烷污染修复中应用，也属于本专利技术的保护范围。
[0020]本专利技术还提供了卤代烷烃脱卤酶的制备方法，所述方法包括：将所述蛋白质的编码基因通过pET
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28a(+)载体导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中得到重组菌，在异丙基
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β
‑
D
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硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下使所述编码基因得到表达，分离得到卤代烷烃脱卤酶。
[0021]具体的，所述蛋白质的编码基因通过pET
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28a(+)载体导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中可通过重组载体pET
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28a
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dhaA导入至所述大肠杆菌中，所述pET
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28a本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.降解1,2,3
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三氯丙烷的方法，包括：向含有1,2,3
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三氯丙烷的无机盐溶液中添加蛋白质进行反应，实现1,2,3
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三氯丙烷的降解；所述蛋白质为如下A1)或A2)：A1)氨基酸序列是SEQ ID NO.1的蛋白质；A2)在A1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述无机盐溶液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为Na2HPO4·
7H2O 7g/L，KH2PO
4 3g/L，(NH4)2SO
4 5g/L，NaCl 3g/L，MgSO4·
7H2O 0.7g/L，利用NaOH调节pH至7.5。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述反应的温度为25
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45℃。4.权利要求1中所述蛋白质在降解1,2,3
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三氯丙烷中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述降解条件为高温环境，或碱性环境，或酸性环境，或高温碱性环境，或高温酸性环境。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：权利要求1中所述蛋白质降解1,2,3
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【专利技术属性】
技术研发人员：代小丽，张忠国，单悦，乔鹏炜，
申请(专利权)人：北京市科学技术研究院资源环境研究所，
类型：发明
国别省市：