自发型皮肤型红斑狼疮动物模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种自发皮肤型红斑狼疮动物模型的构建方法，通过小范围敲除角质形成细胞中的PPARγ（Peroxisome proliferator

【技术实现步骤摘要】
自发型皮肤型红斑狼疮动物模型的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于疾病动物模型构建方法
，具体涉及一种皮肤型红斑狼疮的动物模型的构建。

技术介绍

[0002]皮肤型红斑狼疮(Cutaneous lupus erythematosus,CLE)是一组临床表现多样的自身免疫性皮肤病，根据不同的病情进展可分为多种亚型，不同亚型的皮损表现、病程及预后均不相同，包括急性、亚急性、慢性和间歇性CLE。其中，慢性CLE可进一步分为盘状LE、疣状LE、深部LE、冻疮性LE和Blaschko线状LE等亚类。CLE共同的组织学特征包括界面皮炎和真皮
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表皮交界处自身抗体的沉积。CLE的发病率约为4.2/10万，略高于SLE的发病率(3/10万)。女性的发病率高于男性(5.8/10万比2.4/10万)，发病年龄在30～69岁之间。CLE的患病率为70.4/10万，女性患病率亦较男性高(85.1/10万比56.9/10万)，患病年龄高峰在50～59岁。5％至25％的CLE患者可在病程中进展为系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)，严重威胁患者的健康。
[0003]CLE的发病机制涉及多种因素，包括遗传、表观遗传学和环境因素等影响，各种遗传和环境诱因促进T细胞、B细胞、嗜中性粒细胞、抗原呈递细胞和NK细胞浸润到病变皮肤中。目前的观点认为，CLE的致病途径除了树突细胞激活、T细胞失调、细胞因子失衡、B淋巴细胞缺陷和自身抗体产生外，还有紫外线照射刺激角质形成细胞产生固有免疫相关的细胞因子，并触发细胞死亡，从而激活核酸信号通路。CLE的一线治疗药物主要是抗疟药物和糖皮质激素，而免疫抑制剂、沙利度胺和阿维A用于顽固性CLE的治疗。目前CLE依旧缺乏有效的治疗方式，更好地了解驱动CLE的遗传、环境和免疫调节因素可能为CLE的治疗提供重要依据。然而，对于CLE的发病机制或导致CLE患者进展为SLE的机制知之甚少，部分原因是缺乏合适的动物模型。因此，与CLE患者具有相似遗传背景，能模拟临床症状、又兼具成本优势的自发型动物模型，对研究CLE发病机制及安全有效的新型疗法具有重要意义。
[0004]迄今为止，大多数LE模型都集中在SLE上，包括NZB/W F1小鼠、MRL/lpr小鼠、BXSB/Yaa小鼠和新开发的PD
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1H KO小鼠。这些典型的狼疮小鼠模型很少表现出明显的皮肤损害且皮损异质性很大，病理过程与患者差异巨大，并且缺乏人类CLE的许多关键特征。此外，这些模型需要6个月或更多的时间出现皮损表型，耗时久。新近开发的CLE小鼠模型有IL
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21诱导的人源化CLE小鼠模型，该模型需要注射源自活动性SLE患者的异常免疫细胞，并使用UVB照射诱发狼疮样皮肤表现的发展，其缺点在于操作复杂，同时小鼠模型存在UVB导致的急性损伤表型，与CLE患者临床表现不符。
[0005]PPARγ(Peroxisome proliferator
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activated receptor gamma，过氧化物酶体增殖物激活受体γ)是PPAR通路的关键分子，能调控脂肪细胞分化和功能，调控免疫细胞的成熟和功能，影响组织和器官的细胞增殖，其信号失调还与肿瘤生成有关。目前尚未见到利用角质形成细胞条件性PPARγ敲除小鼠构建自发型CLE动物模型的报道。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，为CLE的发病机制、病理特征、治疗方法研究和开发提供一种新的自发型CLE动物模型。
[0007]为实现上述技术目的，本专利技术公开了一种自发皮肤型红斑狼疮动物模型的构建方法，包括如下步骤：
[0008](1)构建角质形成细胞条件性PPARγ敲除小鼠，所述角质形成细胞条件性PPARγ敲除小鼠为Krt5
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CreERT2+/
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PPARγflox/flox
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/
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的C57BL/6小鼠；
[0009](2)使用基因敲除激活剂小范围敲除角质形成细胞中的PPARγ基因以介导疾病表型发生；所述小范围敲除为对角质形成细胞条件性PPARγ敲除小鼠单耳腹侧及背侧的皮肤、或身上≤4cm2的无毛或剃毛皮肤施用基因敲除激活剂。
[0010]其中，所述基因敲除激活剂为代谢后可与雌激素受体突变体ERT结合，使CreERT2发挥Cre重组酶活性进行基因敲除的化合物。
[0011]在一种实施方式中，所述基因敲除激活剂为4
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羟基他莫昔芬。
[0012]其中，4
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羟基他莫昔芬的使用方式为外用涂抹、皮肤贴敷、有针或无针化的皮下注射或皮内注射中的任意一种。
[0013]具体地，使用4
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羟基他莫昔芬作为基因敲除激活剂时，对角质形成细胞条件性PPARγ敲除小鼠的无毛或剃毛的≤4cm2面积的皮肤涂抹4
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羟基他莫昔芬溶液1
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7天，每天一次，为了便于操作，可以选择单耳的腹侧及背侧的皮肤进行涂抹。
[0014]其中，所述4
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羟基他莫昔芬溶液按照50mg 4
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羟基他莫昔芬、1ml DMSO、3
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49ml玉米油的比例配置，优选地，所述4
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羟基他莫昔芬溶液按照50mg 4
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羟基他莫昔芬、1ml DMSO、9ml玉米油的比例配置；每次给小鼠外用涂抹的4
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羟基他莫昔芬溶液的剂量为10
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80μl。
[0015]其中，小鼠在初次外用涂抹4
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羟基他莫昔芬7
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12天后出现疾病表型。
[0016]具体地，所述角质形成细胞条件性PPARγ敲除小鼠通过如下方法构建得到：
[0017]将PPARγflox/flox和Krt5
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CreERT2小鼠交配，得到杂交生成子一代，保留基因型为Krt5
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CreERT2+/
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PPARγflox/flox+/
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的杂合子小鼠，将杂合子小鼠相互交配繁育得到基因型为Krt5
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CreERT2+/
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PPARγflox/flox
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/
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的小鼠。
[0018]本专利技术进一步提出了通过上述构建方法构建得到的自发皮肤型红斑狼疮动物模型在研究CLE疾病机理上的应用。
[0019]本专利技术还提出了通过上述构建方法构建得到的自发皮肤型红斑狼疮动物模型在筛选靶向治疗狼疮皮损的药物中的应用。
[0020]有益效果：本专利技术通过敲除小鼠角质形成细胞中的PPARγ，构建了一种自发型CLE动物模型，其不需要人工诱导，能条件性出现CLE样表型，包括局部皮肤炎性表型、脱毛，组织学检查有真皮免疫细胞浸润，基底膜带I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种自发皮肤型红斑狼疮动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）构建角质形成细胞条件性PPARγ敲除小鼠，所述角质形成细胞条件性PPARγ敲除小鼠为Krt5
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CreERT2+/
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PPARγ flox/flox
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/
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的C57BL/6小鼠；（2）使用基因敲除激活剂小范围敲除角质形成细胞中的PPARγ基因以介导疾病表型发生；所述小范围敲除为对角质形成细胞条件性PPARγ敲除小鼠单耳腹侧及背侧的皮肤、或身上≤4 cm2的无毛或剃毛皮肤施用基因敲除激活剂。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基因敲除激活剂为代谢后可与雌激素受体突变体ERT结合，使CreERT2发挥Cre重组酶活性进行基因敲除的化合物。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述基因敲除激活剂为4
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羟基他莫昔芬。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，4
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羟基他莫昔芬的使用方式为外用涂抹、皮肤贴敷、有针或无针化的皮下注射或皮内注射中的任意一种。5. 根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，对角质形成细胞条件性PPARγ敲除小鼠单耳腹侧及背侧的皮肤、或身上≤4 cm2的无毛或剃毛皮肤连续涂抹4
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羟基他莫昔芬溶液1
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7天，每天一次。6. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述4
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【专利技术属性】
技术研发人员：陆前进，田婧汝，史丽晴，张丁垚，
申请(专利权)人：中国医学科学院皮肤病医院中国医学科学院皮肤病研究所，
类型：发明
国别省市：