甘露醇在促进蝙蝠蛾幼虫僵化中的应用及冬虫夏草制造技术

本发明专利技术公开了甘露醇在促进蝙蝠蛾幼虫僵化中的应用及冬虫夏草，本发明专利技术通过对照实验，发现了甘露醇在注射到蝙蝠蛾幼虫体内后可以快速促进蝙蝠蛾幼虫进入僵化期，因此得出可以利用冬虫夏草的代谢产物甘露醇制备促进蝙蝠蛾幼虫僵化的制剂。用法S1、选用蝙蝠蛾幼虫5龄虫作为感染对象，选用从冬虫夏草孢子作为感染菌种，通过针刺接种感菌；S2、选取8龄感菌蝙蝠蛾幼虫，从幼虫气孔注入15％

【技术实现步骤摘要】
甘露醇在促进蝙蝠蛾幼虫僵化中的应用及冬虫夏草


[0001]本专利技术涉及冬虫夏草培育
，具体涉及甘露醇在促进蝙蝠蛾幼虫僵化中的应用及使用甘露醇注射快速获得冬虫夏草。

技术介绍

[0002]冬虫夏草是一种有价值的中药，具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌和免疫调节等药理作用。中国冬虫夏草的形成是寄生的结果，在寄生过程中，鳞翅目蝙蝠蛾幼虫被冬虫夏虫夏草(Os)感染，最终形成含有昆虫病原真菌子实体的僵化宿主尸体。蝙蝠蛾和Os都是嗜冷性的，冬虫夏草的分布仅限于海拔3000米至5000米的青藏高原。冬虫夏草的稀缺性和高药用价值导致其价格极高。人工栽培可能会提高冬虫夏草的产量，但由于难以建立昆虫病原真菌及其宿主的实验室模型，冬虫夏草的神秘生命周期尚未揭示，因此只能取得有限的成功。
[0003]现有的研究大多用于对真菌及其宿主的单独研究，如不同菌株Os的分离和遗传鉴定、活性成分的提取和药理机制、Os的大规模发酵等。然而，很少有研究关注真菌与其宿主之间的相互作用。关于真菌如何入侵宿主并发育成子实体，已经取得了一些进展，但真菌如何杀死宿主并完成僵化过程的机制尚未阐明，这将影响冬虫夏草的质量。对于如何提高冬虫夏草产量，如何缩短冬虫夏草的培育周期也是很有必要的研究课题。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术中的不足之处，本专利技术提供甘露醇在促进蝙蝠蛾幼虫僵化中的应用，其加快了蝙蝠蛾幼虫的僵化周期，解决了冬虫夏草培育周期长的问题。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0006]本专利技术通过对照实验，发现了甘露醇在注射到蝙蝠蛾幼虫体内后可以快速促进蝙蝠蛾幼虫僵化，因此得出可以利用冬虫夏草的代谢产物甘露醇制备促进蝙蝠蛾幼虫僵化的制剂。
[0007]本专利技术还旨在提供一种促进蝙蝠蛾幼虫快速僵化的方法，其特征在于：包括以下步骤，
[0008]S1、选用蝙蝠蛾幼虫5龄虫作为感染对象，选用冬虫夏草菌作为感染菌种，通过针刺接种感菌；
[0009]S2、选取8龄感菌蝙蝠蛾幼虫，从幼虫气孔注入15％
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20％的甘露醇20μL，
[0010]S3、在注射15％
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20％甘露醇后相比对照组72H幼虫出现大量僵化。
[0011]进一步地，所述蝙蝠蛾为小金蝠蛾。
[0012]进一步地，步骤S1中每个蝙蝠蛾幼虫接种剂量为2ul浓度为3
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106blastospores/ul的真菌悬浮液。
[0013]进一步地，蝙蝠蛾幼虫的饲养温度为15℃，湿度为80％，饲养饲料为胡萝卜。
[0014]进一步地，8龄感菌蝙蝠蛾幼虫包括幼虫血淋巴菌体状态为胶囊状孢子幼虫和豆荚状孢子幼虫。
[0015]进一步地，步骤S2可替换为定期对感菌蝙蝠蛾幼虫涂抹一定量的15％
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20％的甘露醇或饲喂混合有15％
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20％的甘露醇的饲养饲料。
[0016]本专利技术还旨在提供一种采用甘露醇促进蝙蝠蛾幼虫僵化方法培育的冬虫夏草。
[0017]本专利技术的有益效果包括：注射了甘露醇的蝙蝠蛾幼虫能够快速进入僵化期，可加速蝙蝠蛾幼虫约7天的僵化过程，且对冬虫夏草的质量不产生影响。
附图说明
[0018]图1是本专利技术的8龄未感染小金蝠蛾幼虫和8龄感染幼虫形态及不同时期僵虫对照图；
[0019]图2是本专利技术的僵虫硬度测试示意图；
[0020]图3是本专利技术的僵虫硬度变化图；
[0021]图4是本专利技术的小金蝠蛾幼虫及僵虫不同时期血腔Os的发育阶段图；
[0022]图5是本专利技术的注射对照实验中僵化率对比图；
[0023]图6是本专利技术的微注射系统结构示意图；
[0024]图7是本专利技术的注射过程示意图；
[0025]图8是本专利技术的注射20％甘露醇的僵虫形态变化图；
[0026]图9是本专利技术的注射20％甘露醇的僵虫硬度变化图；
[0027]图10是本专利技术的注射20％甘露醇的小金蝠蛾幼虫及僵虫血腔中Os的发育图；
[0028]图11是本专利技术的冬虫夏草菌在小金蝠蛾幼虫及僵虫体腔内的各阶段的发育阶段分类图；
[0029]图12是本专利技术的胶囊状孢子幼虫注射20％甘露醇僵化率对照图；
[0030]图13是本专利技术的豆荚状孢子幼虫注射20％甘露醇僵化率对照图。
具体实施方式
[0031]下面结合具体实施例及附图来进一步详细说明本专利技术。
[0032]实施例1
[0033]供试宿主：选用采自四川省阿坝藏族羌族自治州小金县高山草甸区的小金蝠蛾H.xiaojinensis蛹在重庆室内羽化、交配、产卵，人工室内胡萝卜饲养。饲养温度为15℃，湿度为80％。实验用的小金蝠蛾种群已在实验室繁殖三代。
[0034]供试冬虫夏草菌：冬虫夏草菌是来自于四川省阿坝藏族羌族自治州小金县的小金虫草中分离、纯化，并在14摄氏度下通过液体葡萄糖蛋白胨培养基发酵产生芽生孢子，并用装有2ul稀释真菌悬浮液(3
×
10 6
blastospores/ul)的玻璃毛细管针刺接种5龄幼虫(头壳2～2.5mm，体长2.8～3.3cm，体重0.20g～0.26g，饲养3个月虫)。
[0035]注射幼虫样本：8龄感菌幼虫(未经过血淋巴筛选的随机样本各100条)、血淋巴镜检为胶囊状孢子的幼虫各100条，血淋巴镜检为豆荚状孢子的幼虫各100条。
[0036]制备注射药品：赤藓糖醇(Erythritol)20％，甘露醇(Mannitol)
[0037]20％,15％,10％,5％，山梨醇(Sorbitol)20％，无菌水，并通过如图6所示的微注射系统(品牌钟楼，型号0.33mm，华西医科大学仪器厂生产)。如图7所示的手法，将20％，15％，10％，5％的甘露醇溶液和山梨醇、赤藓糖醇、水从幼虫(头壳3.5～4mm，体长4～5cm，
体重0.85～0.90g)气孔注射到体内，注射量20ul，不注射为对照。并分别在注射后24h、72h、120h、240h统计其僵化率，及在注射前、24h、72h、120h、240h时间点取血淋巴在显微镜下记录出现假菌丝的条数比例。随后，随机抽取注射后各实验样本的8龄感菌幼虫在24h、72h、120h、240h血淋巴20微升稀释到1毫升0.1％的吐温80溶液中，分别取各自混合液20微升稀释液滴到载玻片上压片，在光学显微镜(型号：BS203生物显微镜)10X(目镜)40倍(物镜)对不同时期血淋巴样本进行菌体形态比例统计。
[0038]注射后硬度测定：选取8龄感菌幼虫、8龄未感菌幼虫、注射后僵化的0h、24h、72h、120h、240h、600h、960h、1320h、1920h的幼虫和僵虫及虫草采用数显邵氏硬度仪测定，型号Model:LXD
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C；NO:21065697；硬度数值范围0～100HC，如图2所示，操作方法：把试样放置在坚固的平面上，手持本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.甘露醇在促进冬虫夏草僵化过程中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：包括甘露醇在制备促进冬虫夏草僵化的制剂中的应用。3.一种促进蝙蝠蛾幼虫快速僵化的方法，其特征在于：包括以下步骤，S1、选用蝙蝠蛾幼虫5龄虫作为感染对象，选用冬虫夏草菌作为感染菌种，通过针刺接种感菌；S2、选取8龄感菌蝙蝠蛾幼虫，从幼虫气孔注入15％
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20％的甘露醇20μL，S3、在注射15％
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20％甘露醇后相比对照组72H幼虫出现大量僵化。4.根据权利要求3所述的一种促进小蝙蝠蛾幼虫快速僵化的方法，其特征在于：所述蝙蝠蛾为小金蝠蛾。5.根据权利要求3所述的一种促进蝙蝠蛾幼虫快速僵化的方法，其特征在于：蝙蝠蛾幼虫的饲养温度为15℃，湿度为80％，饲养饲料...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴文敏，毛先兵，卜俊熙，卜京，谢宇，谭术英，
申请(专利权)人：重庆欣时达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：