一种从大肠杆菌发酵液中提取透明质酸钠的方法技术

本发明专利技术公开了一种从大肠杆菌发酵液中提取透明质酸钠的方法，包括以下步骤：先将透明质酸发酵液进行稀释，然后将发酵液的pH调至4.0

【技术实现步骤摘要】
一种从大肠杆菌发酵液中提取透明质酸钠的方法


[0001]本专利技术涉及从大肠杆菌发酵液提取透明质酸钠的方法。

技术介绍

[0002]透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)又名玻璃酸，是一种酸性的直链粘多糖，广泛分布于自然界。透明质酸是由葡萄糖醛酸和N
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乙酰葡萄糖胺重复单元通过糖苷键连接得到，具有极强的保湿性、粘弹性和渗透性。目前广泛的应用于食品、医药、化妆品等行业，其各类产品深入到人们生活的方方面面。
[0003]目前，透明质酸的来源主要包括动物提取和微生物发酵。动物提取主要来源是鸡冠和脐带，提取工艺工艺复杂、效率低，以及存在动物病毒种间的污染，同时动物提取原料的来源受到极大的限制，对大规模的生产有较大的阻碍。近些年，透明质酸获取方式通过微生物发酵，主要通过兽疫链球菌发酵获得，发酵原料来源易得，容易进行大规模的生产。但是兽疫链球菌本身的致病性，以及溶血性和透明质酸酶的释放，在一定程度上限制了野生兽疫链球菌工业化的应用。
[0004]本专利技术的发酵液来自大肠杆菌的发酵液，相比于兽疫链球菌，大肠杆菌基因组相对明确，是一种更加安全可靠的微生物宿主。现有从大肠杆菌发酵液中透明质酸钠的方法所得的透明质酸钠杂质含量较高，品质较低。

技术实现思路

[0005]本专利技术为解决上述问题，提供了一种纯化效率高、透明质酸成品质量高的纯化方法，可以很好的分离透明质酸钠中核酸和蛋白等杂质。
[0006]为了实现本专利技术目的，本专利技术提供了一种从大肠杆菌发酵液中提取透明质酸钠的方法，包括下列步骤：
[0007]1)用纯水将大肠杆菌发酵液稀释至原体积的2
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6倍得到稀释液，优选4倍，加入酸调节pH，使稀释液的pH达到4.0
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4.5，优选pH为4.5；搅拌离心，收集上清液，用碱性溶液回调上清液pH至6.0
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7.0，优选pH为4.5；
[0008]2)将步骤1)得到上清液过滤，向滤液中添加2
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4倍上清液体积的乙醇进行醇沉，优选2倍，获得透明质酸钠粗沉淀；
[0009]3)用步骤1)稀释液同体积的0.3％
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0.9％氯化钠溶液溶解步骤2)所得透明质酸钠粗沉淀；溶解完全后，加入蛋白酶，在30
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45℃酶解1
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5h得到酶解液；向所述酶解液添加活性炭，在室温下吸附后过滤获得滤液；
[0010]4)向步骤3)所得滤液加入十六烷基三甲基氯化铵络合，络合20
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40min；收集络合物沉淀，用步骤1)稀释液同体积的20
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40g/L的氯化钠溶液进行解离，获得解离液；解离液添加3
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7g/L活性炭，在室温条件下吸附15
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45min，过滤获得滤液；
[0011]5)将步骤4)所得滤液过0.45um滤膜，得到澄清的透明质酸钠溶液，往溶液添加2
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4倍体积的乙醇进行醇沉，将沉淀脱水干燥即得所述透明质酸钠。
[0012]所述步骤1)中先将发酵液进行稀释，是由于发酵液的粘度过高，加纯水稀释可以加快下游的过滤速度，提高纯化效率。
[0013]作为优选，步骤3)所述蛋白酶选自胰蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的一种，优选为胰蛋白酶；添加量为0.01
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0.03g/L。
[0014]作为优选，步骤4)所述十六烷基三甲基氯化铵的用量为步骤2)所得透明质酸钠粗沉淀质量的1
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3倍。
[0015]作为优选，步骤1)所述酸选自乙酸、盐酸和三氯乙酸；所述碱性溶液选自氢氧化钠或氢氧化钾溶液。将pH先调节为酸性主要是进行蛋白的酸沉淀，使蛋白杂质进行初步去除。
[0016]作为优选，步骤2)和步骤5)中所述醇沉所用乙醇为原溶液体积的2
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4倍，醇沉时长20min
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40min；醇沉后用乙醇清洗沉淀2
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4次；所述乙醇纯度为95％。每次清洗沉淀所用的乙醇体积与发酵液相同，清晰2
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4次以确保将大量杂质洗脱。
[0017]作为优选，步骤4)所述解离前，用纯化水清洗络合物沉淀2
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3次，优选为3次；步骤4)解离所用氯化钠溶液浓度为3％，解离时长1
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3h。
[0018]作为优选，步骤2)
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5)过滤操作前均用硅藻土预铺过滤。抽滤时采用负压，通常为真空过滤，由于透明质酸钠溶液较为粘稠，需要较长时间进行过滤。
[0019]作为优选，步骤5)所述干燥为真空干燥，干燥温度为40
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60℃，干燥时间为14
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18h。步骤5)所述脱水为无水乙醇进行。
[0020]作为优选，步骤3)所述活性炭的添加量为5
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15g/L，吸附时间为15
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45min；步骤4)所述活性炭的添加量为3
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7g/L，吸附时间为15
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45min。
[0021]作为优选，步骤1)所述搅拌时间为30min
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1.5h；离心条件为10000rpm、30min。
[0022]本专利技术从大肠杆菌发酵液提取透明质酸的方法，具有以下优势：1)获得的透明质酸钠成品质量较高，杂质含量低，核酸A260低于0.1％，蛋白含量低于0.05％，分子量在110
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140W；2)选择的纯化试剂较易获得；3)整体工艺对环境污染小。
具体实施方式
[0023]以下将通过实施例来详细说明本申请的实施方式，借此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0024]本申请还存在其它多种可实施的技术方案，在此不做一一列举，本申请权利要求中要求保护的技术方案都是可以实施的。
[0025]发酵液制备：
[0026]本申请所有实施例及对比例均使用同一批次发酵液。发酵液所用菌种来自于中科院微生物所，通过专利CN105368761方法构建。透明质酸发酵方法参考CN105368761第0081
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0084段，所得发酵液中透明质酸的含量为12
±
0.5g/L。
[0027]实施例1
[0028]本专利技术：取透明质酸12g/L发酵液500ml，加纯水稀释至2000ml，加入乙酸调pH至4.5，搅拌1h后，10000rpm，离心30min，收集上清液。用氢氧化钠溶液回调上清液pH至6.5；预铺硅藻土对上清液进行过滤，往滤液添加4L的95％乙醇进行醇沉，倒出上清液，加入0.5L的95％乙醇，搅拌10min，倒出上清液，重复对沉淀进行三次清洗，获得透明质酸钠粗沉淀；往沉淀中加入2L的0.6％氯化钠溶液。溶解完全后，以0.03g/L的标准加入0.06g胰蛋白酶，在
37℃条件下酶解3h，酶解液添加1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从大肠杆菌发酵液中提取透明质酸钠的方法，其特征在于，包括下列步骤：1)用纯水将大肠杆菌发酵液稀释至原体积的2
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6倍得到稀释液，优选4倍，加入酸调节pH，使稀释液的pH达到4.0
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4.5，优选pH为4.5；搅拌离心，收集上清液，用碱性溶液回调上清液pH至6.0
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7.0，优选pH为4.5；2)将步骤1)得到上清液过滤，向滤液中添加2
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4倍上清液体积的乙醇进行醇沉，优选2倍，获得透明质酸钠粗沉淀；3)用步骤1)稀释液同体积的0.3％
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0.9％氯化钠溶液溶解步骤2)所得透明质酸钠粗沉淀；溶解完全后，加入蛋白酶，在30
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45℃酶解1
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5h得到酶解液；向所述酶解液添加活性炭，在室温下吸附后过滤获得滤液；4)向步骤3)所得滤液加入十六烷基三甲基氯化铵络合，络合20
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40min；收集络合物沉淀，用步骤1)稀释液同体积的20
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40g/L的氯化钠溶液进行解离，获得解离液；解离液添加3
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7g/L活性炭，在室温条件下吸附15
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45min，过滤获得滤液；5)将步骤4)所得滤液过0.45um滤膜，得到澄清的透明质酸钠溶液，往溶液添加2
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4倍体积的乙醇进行醇沉，将沉淀脱水干燥即得所述透明质酸钠。2.如权利要求1所述提取透明质酸钠的方法，其特征在于，步骤3)所述蛋白酶选自胰蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的一种，优选为胰蛋白酶；添加量为0.01
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0.03g/L。3.如权利要求1所述提取透明质酸钠的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张燕南，陈晓超，冯幸福，
申请(专利权)人：浙江诺维芙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：