血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及体外检测技术领域，尤其涉及血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒。本发明专利技术具体提供了羧基磁珠的制备方法及其应用，利用该方法制备的羧基磁珠表面羧基含量高，与抗原或抗体的偶联率高。利用本发明专利技术提供的羧基磁珠制备的血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒性质稳定、测值准确性和重复性好，能够应用于临床。能够应用于临床。

【技术实现步骤摘要】
血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及体外检测
，尤其涉及血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒。

技术介绍

[0002]血栓调节蛋白(Thrombomodulin,TM)是一种存在于细胞膜表面的跨膜糖蛋白，由巨核细胞和内皮细胞合成，普遍分布于血管内皮细胞表面。TM与凝血酶结合后会降低凝血酶的凝血活性，而加强其激活蛋白C的活性，由于激活的蛋白C具有抗凝作用，因此TM是重要的凝血抑制因子。正常生理状态下，TM分布于细胞质膜表面，当血管内皮细胞受到损伤后，常常引起TM表达、分泌异常和释放入血液，引起血浆中血栓调节蛋白含量的变化。临床上血液TM含量的升高见于弥散性血管内凝血、急性心肌梗死和脑血栓等疾病，因此血栓调节蛋白含量的测定对于一些疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
[0003]目前，测定血栓调节蛋白的方法主要是酶联免疫吸附法(ELISA)和放射免疫分析法(RIA)。但二者在实际应用中都存在一些缺陷，酶联免疫吸附法操作繁琐，耗时长、测试结果不稳定、重复性差，不方便随到随测和医院急诊；放射免疫分析法具有放射性污染，测试结果不稳定，且所需仪器较昂贵。因此，开发一种操作简单、能够快速准确检测血栓调节蛋白的试剂盒十分必要。磁性纳米颗粒具有比表面积大、分离清洗速度快、重现性好、可偶联标记等优点，已经有研究者将磁微粒作为检测载体应用于临床项目检测。以磁性纳米颗粒为基础的磁微粒化学发光免疫分析法(CLIA)将具有高灵敏度的化学发光测定技术和高特异性的免疫反应相结合，具有灵敏度高、线性范围宽、特异性高、测值稳定、高自动化等特点。磁微粒化学发光法结合磁分离技术、免疫分析技术和化学发光技术完成对特定抗原的定量测定，抗原首先与包被在磁珠表面的抗体1结合，形成稳定的抗原
‑
抗体1复合物，酶标抗体进而与抗原其他位点结合形成双抗体夹心复合物，标记在抗体上的碱性磷酸酶催化水解发光底物发出光信号。光信号值与碱性磷酸酶浓度呈正相关，通过化学发光仪检测分析实现双抗体夹心复合物(抗原)的定量测试。
[0004]现有方法制备的羧基磁珠，工艺重复性差、产品质量不稳定，且抗原或抗体偶联率、上机检测结果不佳；TM磁微粒化学发光测定试剂盒多采用链霉亲和素
‑
生物素或放射性元素标记，检测结果易受过量标记物干扰、具有放射性危害。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒。具体提供一种核壳式超顺磁性磁微粒的制备方法，以及包被血栓调节蛋白抗体1的磁微粒悬浮液(免疫磁珠)、碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体2(酶标抗体)的制备。
[0006]本专利技术提供了羧基磁珠的制备方法，包括将可溶性三价铁离子盐制成纳米微粒内核，用二氧化硅包被后与羧基化硅烷反应，磁分离后得到。
[0007]具体的，所述将可溶性三价铁离子盐制成纳米微粒内核的步骤包括将可溶性三价铁离子盐、乙酸钠、高分子聚合物与乙二醇和乙二胺混合溶液反应，磁分离后得到Fe3O4纳米
微粒；
[0008]所述高分子聚合物选自聚氧乙烯类、聚乳酸、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠中的任意一种，在本专利技术的实施例中，所述高分子聚合物为羧甲基纤维素钠；
[0009]所述反应的温度为180～300℃，反应的时间为6～12h，在本专利技术的实施例中，反应的温度为220℃，反应时间为8h。
[0010]具体的，所述二氧化硅包被纳米微粒内核的步骤包括将Fe3O4纳米微粒用碱液重悬后与正硅酸乙酯反应，磁分离后得到二氧化硅包被的Fe3O4纳米微粒；
[0011]所述正硅酸乙酯与Fe3O4纳米微粒的质量比为1：(10～30)；
[0012]所述Fe3O4纳米微粒重悬后的重悬液pH值为10～12，优选pH值为10.5；
[0013]所述正硅酸乙酯溶于乙醇中，所述正硅酸乙酯的浓度为10％；
[0014]所述反应的温度为25～50℃，优选为25℃，反应的时间为3～6h，优选为5h。
[0015]具体的，所述羧基化硅烷的制备方法包括将氨基硅烷与酸酐在无水溶剂中反应1～2h得到；
[0016]所述氨基硅烷与酸酐的摩尔比为1：(2～30)，优选为1:10；
[0017]所述氨基硅烷选自乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三(β
‑
甲氧乙氧基)硅烷)、(3
‑
巯基丙基)三甲氧基硅烷中的任意一种，优选为乙烯基三(β
‑
甲氧乙氧基)硅烷)；
[0018]所述酸酐选自己酸酐、苯硫代甲酸酐、苯磺酸酐、乙丙酸酐、环己甲酸酐、乙氯乙酸酐中的任意一种，优选为乙氯乙酸酐。
[0019]在相同的摩尔比例下，氨基硅烷和酸酐的种类会影响二氧化硅包被的Fe3O4纳米微粒表面羧基修饰的数量和位点，进而影响抗体的偶联率，影响试剂盒的检测，因此本专利技术对不同氨基硅烷和酸酐进行了筛选，结果表明利用乙烯基三(β
‑
甲氧乙氧基)硅烷)和乙氯乙酸酐制备的羧基磁珠偶联率最高，变异系数最小，优于其他氨基硅烷和酸酐制备的磁珠。
[0020]具体的，所述二氧化硅包被后的Fe3O4纳米微粒与羧基化硅烷反应的步骤包括将羧基硅烷溶于无水乙醇后与二氧化硅包被的Fe3O4纳米微粒反应2～6h，磁分离后得到；
[0021]所述反应的温度为25～50℃，优选为25℃，pH值为10～20，优选为11。
[0022]本专利技术提供了羧基磁珠，其由本专利技术所述制备方法获得。本专利技术提供的羧基磁珠表面羧基含量较高，有利于磁珠表面抗体的偶联。
[0023]利用本专利技术提供的羧基磁珠制备的免疫磁珠与市售磁珠制备的免疫磁珠相比，偶联率高且稳定，能够广泛应用于化学发光检测试剂盒的制备，因此本专利技术提供了所述羧基磁珠在制备化学发光检测试剂盒中的应用。
[0024]本专利技术还提供了血栓调节蛋白检测试剂盒，其包括利用本专利技术所述的羧基磁珠制备的免疫磁珠和酶标TM抗体；
[0025]所述免疫磁珠偶联TM抗体1；所述酶标TM抗体为碱性磷酸酶标记的TM抗体2；
[0026]具体的，所述TM抗体1和2包括单克隆抗体或具有Fab活性的改性抗体片段、抗体、抗体片段多聚体，可与人TM表面抗原决定簇特异性结合，可来源于鼠、兔、羊、犬等动物，优选为鼠源单克隆抗体；
[0027]所述TM抗体1和2为市售抗体；
[0028]所述羧基磁珠与TM抗体1的质量比为(10～200)：1，优选为50:1；
[0029]所述碱性磷酸酶与TM抗体2的质量比为(0.5～10)：1，优选为1:1。
[0030]在一些具体的实施例中，所述羧基磁珠偶联TM抗体1可通过EDC、EDC/NHS、EDC/Sulfo
‑
NHS等活化剂偶联，优选EDC/Sulfo
‑
NHS。偶联步骤如下：
[0031]a)将磁微粒均匀分散在活化缓冲液中；
[0032]b)使用活化缓冲液溶解活化剂，加入本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.羧基磁珠的制备方法，其特征在于，包括将可溶性三价铁离子盐制成纳米微粒内核，用二氧化硅包被后与羧基化硅烷反应，磁分离后得到。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将可溶性三价铁离子盐制成纳米微粒内核的步骤包括将可溶性三价铁离子盐、乙酸钠、高分子聚合物与乙二醇和乙二胺混合溶液反应，磁分离后得到Fe3O4纳米微粒；所述高分子聚合物选自聚氧乙烯类、聚乳酸、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠中的任意一种；所述反应的温度为180～300℃，反应的时间为6～12h。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述二氧化硅包被纳米微粒内核的步骤包括将Fe3O4纳米微粒重悬后与正硅酸乙酯反应，磁分离后得到二氧化硅包被的Fe3O4纳米微粒；所述正硅酸乙酯与Fe3O4纳米微粒的质量比为1：(10～30)；所述Fe3O4纳米微粒重悬后的重悬液pH值为10～12；所述正硅酸乙酯溶于乙醇中；所述反应的温度为25～50℃，反应的时间为3～6h。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述羧基化硅烷的制备方法包括将氨基硅烷与酸酐在无水溶剂中反应1～2h得到；所述氨基硅烷与酸酐的摩尔比为1：(2～30)；所述氨基硅烷选自乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三(β
‑
甲氧乙氧基)硅烷)、(3...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢永华，王肖楠，
申请(专利权)人：上海太阳生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：