枇杷抗寒基因EjGLK1及其编码的蛋白与应用制造技术

本发明专利技术涉及植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷叶抗寒相关基因EjGLK1及其编码的蛋白质和应用。该基因的cDNA序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术所述的EjGLK1基因通过影响叶绿体相关基因合成及影响低温胁迫通路ICE

【技术实现步骤摘要】
枇杷抗寒基因EjGLK1及其编码的蛋白与应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及枇杷抗寒基因EjGLK1及其编码的蛋白和应用。

技术介绍

[0002]枇杷是原产于中国的蔷薇科枇杷属果树，其果实成熟于春夏之际的水果淡季且具有独特风味，因此受到消费者喜爱。枇杷夏秋花芽分化，秋冬开花坐果，因此极易受到低温甚至冻害影响从而影响枇杷产量(蒋际谋，陈秀萍，邓朝军，许奇志，郑少泉.(2018).我国枇杷产业优劣势分析与发展对策.中国园艺文摘，34(4)，4)。中国的主要产区如浙江、福建、重庆等，均有报道表明低温甚至冻害严重影响枇杷产量甚至使枇杷死亡(蔡礼鸿，(2012).枇杷学)。
[0003]较常规杂交育种，枇杷倍性育种快速高效，如三倍体枇杷相比二倍体枇杷具有果实无核，营养生长旺盛的特点(彭思维，王永清，严娟，陶炼.(2011).三倍体枇杷育种的研究进展.全国枇杷学术研讨会)。由于培育得到的多倍体具有较强抗逆性，因此高产的优质枇杷品种逐渐成为解决枇杷低温冻害的有效措施之一。对于枇杷抗寒研究结果表明，三倍体枇杷相比二、四倍体枇杷具有显著的抗冷冻胁迫，同时其光合效率等都得到显著提高(刘明秀，2021)。
[0004]枇杷易受到低温冰冻灾害从而使光合作用受到严重影响，最终影响枇杷产量甚至存活率。而通过对枇杷EjGLK1基因调控解析，有利于对其功能的进一步解析，对于枇杷的抗冷冻胁迫有重要作用，同时为分子标记等奠定理论基础。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供枇杷EjGLK1(Golden2
‑
like 1)及其编码的蛋白和应用。
[0006]本专利技术提供一种维持枇杷抗寒性相关的基因EjGLK1，所述EjGLK1的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]本专利技术提供了上述维持枇杷EjGLK1编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0008]本专利技术提供了上述维持枇杷基因EjGLK1的扩增引物对，其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0009]本专利技术提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。
[0010]本专利技术还提供所述基因在调控枇杷抗寒中的用途。
[0011]本专利技术提供了一种转化体，所述转化体由上述表达载体转化宿主获得。
[0012]本专利技术提供了枇杷EjGLK1及其蛋白质、表达载体或转化体在提高枇杷抗寒性育种中的应用。
[0013]本专利技术从具有抗寒的三倍体品种中克隆得到1个相关的基因EjGLK1，发现其定位于细胞核。通过实时荧光定量PCR证实了EjGLK1基因在枇杷低温处理后表达量显著升高，且
在抗寒的三倍体中表达最高，也表明了EjGLK1基因具有提高枇杷低温抗逆性的作用。利用基因工程手段构建了EjGLK1基因的植物过表达载体，将其在GLK1双突的拟南芥glk1glk2中超量表达，结果影响叶绿体发育相关基因的表达及叶绿素的含量，并使glk1glk2双突变型由黄白色恢复为正常绿色。同时，也显著影响了低温胁迫途径关键调控通路ICE
‑
CBF
‑
CORs中相关基因的变化，以及ROS相关酶的表达，最终提高拟南芥的抗寒性。本专利技术为被子植物的低温胁迫调控提供了良好的应用前景。
附图说明
[0014]图1所示是枇杷EjGLK1基因的克隆电泳照片。其中，M为DL2000 DNA marker，1为EjGLK1基因ORF的PCR产物，长度为1620bp。
[0015]图2所示是枇杷EjGLK1编码蛋白质的氨基酸序列与苹果、梨、拟南芥、桃、杨树、茶、蓖麻、葡萄、香蕉、黄麻、烟草、小米、荷花的序列对比，均具有高度保守的TEA domain及GCT
‑
box跨膜结构域。
[0016]图3所示是枇杷EjGLK1基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位，表明EjGLK1蛋白定位于细胞核。GFP：绿色荧光蛋白；DAPI：细胞核染料染色荧光信号；Bright Field：明场成像；Merged：GFP，DAPI和Bright Fild的合并后的图像。
[0017]图4所示是EjGLK1转基因拟南芥阳性鉴定。(A)PCR扩增鉴定；(B)RT
‑
qPCR鉴定。M:DL2000 DNA marker；+:阳性对照；
‑
:阴性对照；glk1glk2:拟南芥双突变体。
[0018]图5所示是GLK1基因缺失的拟南芥双突变体glk1glk2与野生型表型及表达量鉴定。
[0019]图6所示是EjGLK1转基因拟南芥与突变体及野生型冷冻胁迫处理前后差异表型及相关基因的表达量测定。(A)EjGLK1转基因拟南芥与突变体及野生型常温及冷冻胁迫处理前后差异表型；(B)EjGLK1转基因拟南芥与突变体及野生型的叶绿素含量；(C)EjGLK1转基因拟南芥与突变体及野生型常温及冷冻胁迫处理前后存活率统计；(D)电导率测定；(E
‑
H)叶绿体合成相关基因的表达量测定。
[0020]图7所示是EjGLK1转基因拟南芥与突变体及野生型低温通路ICE
‑
CBF
‑
CORs相关基因表达量测定。
[0021]图8所示是EjGLK1转基因拟南芥与突变体及野生型ROS相关酶活的测定。
具体实施方式
[0022]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0023]实施例1枇杷EjGLK1基因序列的分子克隆
[0024]三倍体枇杷叶片总RNA的提取
[0025]使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取抗寒三倍体枇杷叶片RNA，后使用逆转录试剂盒得到相应的cDNA，并对相应的RNA在
‑
80℃超低温冰箱中保存。
[0026]根据本团队前期枇杷重测序数据，在枇杷EjGLK1基因编码的全长序列两端设计同源重组引物，其正向引物序列为:EjGLK
‑
F:aattaccatggggcgcgccATGCTTCTTTTATCACCTTTGAGG；其反向引物序列为:EjGLK
‑
R:tagactcacctaggatccTCAAGCACAGGAGGGTGGAAATTT。
[0027]使用反转录所得的cDNA为模板，使用引物EjGLK
‑
F和EjGLK
‑
R，对枇杷EjGLK1基因进行PCR扩增。PCR扩增体系及反应条件如下：扩增总体积为20μL，高保真酶PrimerSTAR10μL，ddH2O为7μL，模板(叶片的总cDNA)为1μL，上游引物EjGLK
‑
F为1μL，下游引物EjGLK
‑
R为1μL。反应条件依次为：95℃...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.枇杷EjGLK1蛋白，其为：1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述的枇杷EjGLK1蛋白的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。4.含有权利要求2或3所述基因的载体。5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。7.权利要求2或3所述基因在低温胁迫下影响低温调控通路ICE
‑
CBF
‑
CORs相关基因的表达，从而增加植物抗寒性的用途。8.如权利要求7所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭启高，锁晓栋，杨灏，徐勋，刘明秀，梁国鲁，景丹龙，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：