一种真菌橙花醇合酶PgfB及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种真菌橙花醇合酶PgfB及其编码基因和应用，所述真菌橙花醇合酶PgfB的蛋白序列如SEQ ID NO.6所示，所述真菌橙花醇合酶PgfB基因的核酸序列如SEQ ID NO.5所示；利用融合标签在大肠杆菌中表达真菌橙花醇合酶PgfB获得可溶性蛋白PgfB，体外酶活实验证明，PgfB可直接催化底物GPP反应生成橙花醇；构建含有pgfB基因的重组表达载体并在酿酒酵母体内表达，实现了橙花醇高效异源生产；本发明专利技术首次从真菌中克隆得到橙花醇合酶基因pgfB，可用于体内或体外合成橙花醇，本发明专利技术涉及的酵母异源表达合成橙花醇，环境友好，易于实现，具有潜在的工业化应用前景。潜在的工业化应用前景。潜在的工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种真菌橙花醇合酶PgfB及其编码基因和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种真菌橙花醇合酶PgfB及其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]萜类化合物是自然界众多结构类型的天然产物中数量和种类最多的一类，且具有广泛的生理和药理活性。橙花醇(Nerol，C
10
H
18
O)是一种具有令人愉快的玫瑰和橙花香气的无环单萜化合物，广泛应用于食品、药品、化妆品等行业，有着重要商业价值。全球每年对橙花醇的需求量超过5000吨，但其年生产能力仅为3000吨左右，存在生产能力不足的问题。
[0003]橙花醇天然存在于植物精油中，但从植物中直接提取萜类化合物，由于栽培难度大、产量低、提取分离成本高，效率低，无法满足橙花醇的需求。目前大规模生产橙花醇主要是通过化学合成方法，但是其成本高，工艺复杂，污染严重，收率低，副产物多等缺点，极大地限制了橙花醇的生产及其应用。因此，与上述方法相比，微生物代谢工程和合成生物学已成为获得橙花醇的环境友好且高效的方法，具有广阔的发展前景。在橙花醇生物合成途径中，橙花醇合酶是催化产生橙花醇的关键酶，可催化前体底物直接合成得到橙花醇。然而，迄今为止尚未有真菌来源的橙花醇合酶基因被克隆和鉴定。
[0004]灰黄青霉菌是一种重要的植物病原真菌，基因组挖掘显示其含有多个萜类合成相关的基因，但灰黄青霉菌中未见单萜合成酶基因的相关报道。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种真菌橙花醇合酶PgfB；本专利技术的目的之二在于提供编码真菌橙花醇合酶PgfB的基因；本专利技术的目的之三在于提供含有所述真菌橙花醇合酶PgfB基因的重组表达载体；本专利技术的目的之四在于提供所述重组表达载体在大肠杆菌中生产PgfB重组蛋白中的应用；本专利技术的目的之五在于提供所述重组表达载体在酵母中生产橙花醇中的应用。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]1、一种真菌橙花醇合酶PgfB，所述真菌橙花醇合酶PgfB的蛋白序列如SEQ ID NO.6所示。
[0008]2、编码真菌橙花醇合酶PgfB的基因，所述真菌橙花醇合酶PgfB基因的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0009]3、含有所述真菌橙花醇合酶PgfB基因的重组表达载体。
[0010]本专利技术优选的，所述重组表达载体通过同源重组的方式，将SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物序列扩增得到的真菌橙花醇合酶PgfB基因片段构建到原核表达载体pQ8上。
[0011]本专利技术优选的，所述重组表达载体通过NdeI和SwaI酶切位点将真菌橙花醇合酶PgfB基因构建到酵母表达载体pYEU上。
[0012]4、所述重组表达载体在大肠杆菌中生产PgfB重组蛋白中的应用。
[0013]本专利技术优选的，包含如下步骤：将所述的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后，收集菌体后裂解，取上清液经糊精琼脂糖凝胶纯化，麦芽糖洗脱得到带MBP标签的PgfB重组蛋白。
[0014]5、所述重组表达载体在酵母中生产橙花醇中的应用。
[0015]本专利技术优选的，将所述重组表达载体转化酿酒酵母，获得转基因菌株，经缺U培养基培养后，即获得含有橙花醇的发酵液，正己烷萃取，减压浓缩干后，得到橙花醇。
[0016]本专利技术的有益效果在于：
[0017]本专利技术从灰黄青霉菌中克隆得到单萜合酶基因pgfB，利用融合标签在大肠杆菌中表达获得可溶性蛋白PgfB。体外酶活实验证明，PgfB可直接催化底物GPP反应生成橙花醇，证明该基因编码橙花醇合酶，且PgfB具有严格的底物选择性，并不能识别其他碳链长的底物。同时，本专利技术还成功构建得到含有pgfB基因的重组表达载体并在酿酒酵母体内表达，实现了橙花醇高效异源生产。因此，本专利技术首次从真菌中克隆得到橙花醇合酶基因pgfB，可用于体内或体外合成橙花醇，本专利技术涉及的酵母异源表达合成橙花醇，环境友好，易于实现，具有潜在的工业化应用前景。
附图说明
[0018]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：
[0019]图1为P.griseofulvum NRRL 35584总RNA核酸电泳图；
[0020]图2为pgfB基因片段核酸电泳图；
[0021]图3为pQ8
‑
pgfB重组质粒图谱；
[0022]图4为纯化后的PgfB蛋白SDS
‑
PAGE检测；
[0023]图5为PgfB与GPP的体外酶活实验；
[0024]图6为PgfB与FPP和GGPP体外酶活实验；
[0025]图7为pYEU
‑
pgfB重组质粒图谱；
[0026]图8为GC
‑
MS分析基因pgfB酵母异源表达产物；
[0027]图9为化合物结构鉴定结果。
具体实施方式
[0028]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0029]本专利技术所使用的试剂：
[0030]限制性内切酶购自Takara；Hieff Canace
TM
High
‑
Fidelity DNA Polymerase、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和One Step Cloning Kit购自Yeasen；Frozen
‑
EZ酵母转化II试剂盒购自Zymo Research；Trizol购自Ambion；FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit和BCA蛋白定量试剂盒购自鼎国昌盛生物科技有限公司；GPP购自Sigma
‑
Aldrich；橙花醇标准品购自Aladdin；DH5a和BL21(DE3)大肠感受态细胞购自擎科生物试剂有限公司。
[0031]本专利技术所使用的引物：
[0032]利用snapgene软件设计包含完整开放阅读框的引物(表1)，并由上海生工生物工程技术服务有限公司(成都分公司)进行引物合成。
[0033]表1.本专利技术所涉及引物
[0034][0035]实施例1、灰黄青霉菌总RNA提取及cDNA第一链的合成
[0036]P.griseofulvum NRRL 35584孢子液接种于40mL PDB培养基中，25℃、220rpm培养3天，离心收集菌体。然后将菌体置于预冷无菌的研钵中，加入液氮，用研杵迅速研磨，循环研磨三次至菌体成粉末状。使用Trizol试剂，参照说明书要求从菌体组织样中提取总RNA，并用无RNase的DNase I去除基因组DNA以得到纯化的RNA(图1)。最后，采用Transcriptor First Strand c本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种真菌橙花醇合酶PgfB，其特征在于，所述真菌橙花醇合酶PgfB的蛋白序列如SEQ ID NO.6所示。2.编码真菌橙花醇合酶PgfB的基因，其特征在于，所述真菌橙花醇合酶PgfB基因的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。3.含有权利要求2所述真菌橙花醇合酶PgfB基因的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体通过同源重组的方式，将SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物序列扩增得到的真菌橙花醇合酶PgfB基因片段构建到原核表达载体pQ8上。5.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体通过NdeⅠ和SwaⅠ酶切位点将真菌橙...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾海春，李茹梦，姚波，柴水琴，
申请(专利权)人：重庆科技学院，
类型：发明
国别省市：