一种还原型谷胱甘肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种还原型谷胱甘肽的制备方法，属于肽的制备技术领域。对表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21进行培养，中后期流加葡萄糖溶液作为碳源，根据OD600值进行诱导，进行发酵，对发酵体系进行超滤，滤液用铜盐法进行分离，得到谷胱甘肽溶液；再对谷胱甘肽溶液进行浓缩、结晶得到β晶型产品；对β晶型产品重新溶解，转换晶型得到α晶型产品。本发明专利技术构建表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21进行生物发酵制备还原型谷胱甘肽；再通过改变碳源减少了谷胱甘肽制备过程中杂质的产生，再结合铜盐法提取、β结晶将杂质G完全去除，得到纯度更高的晶型为α晶型的谷胱甘肽产品。型为α晶型的谷胱甘肽产品。型为α晶型的谷胱甘肽产品。

【技术实现步骤摘要】
一种还原型谷胱甘肽的制备方法


[0001]本专利技术涉及肽的制备
，具体涉及一种还原型谷胱甘肽的制备方法。

技术介绍

[0002]谷胱甘肽（glutathione， GSH）是动物、植物及微生物中广泛存在的巯基化合物，在人体内的生化防御体系中起重要作用，具有抗自由基，抗衰老，抗氧化等多方面的生理功能，能够提高人体的免疫力。还原性谷胱甘肽在临床上已经得到广泛应用，例如作为解毒剂、抗氧化剂、抗过敏剂，以及作为肝脏疾病的主要治疗药物和其他多种疾病的辅助治疗药物。
[0003]从1888年发现GSH以来，GSH已经实现工业化生产，目前生产方法主要有萃取法、化学合成法、酶法和发酵法，其中应用最广的是酶法和发酵法。溶剂萃取法是通过向动植物组织或酵母中添加蛋白酶、淀粉酶进行预处理，用溶剂进行抽提萃取，经浓缩，分离精制得到GSH，此方法获得的GSH回收率低、生产成本高且存在污染；化学合成法是使用GSH的三种前体氨基酸作为原料，经过一系列化学缩合生成GSH，此方法比较成熟，在20世纪50年代已经工业生产，但此方法存在反应时间长、反应步骤多、工艺复杂、易造成污染以及存在GSH的消旋体需要拆分等缺点。酶法是目前研究最广泛的GSH的合成方法之一，此法是谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸在ATP及Mg
2+
存在下，经γ
‑
谷氨酰胺半胱氨酸合成酶（GSHⅠ，γ
‑
GCS，由gshⅠ编码）及谷胱甘肽合成酶（GSHⅡ，GS，由gshⅡ编码）的催化合成。酶法在实际应用中，如果使用原核生物或粗酶液需要添加ATP，但对于工业生产来说，直接添加ATP是不现实的。有研究报道采用ATP再生系统调高了ATP的供给，但仍然仅限研究，无法工业应用。对ATP的需求使得酶法很难应用于大规模生产。与其它方法相比，发酵法具有反应条件温和、成本低、生产速率快、反应步骤简单等优点，是目前工业上应用最广泛的一种。发酵法最突出的特点是应用葡萄糖、淀粉等些相对廉价的物质作为生产原料，利用自身的代谢系统合成GSH。在GSH的生产中，选择合适的GSH生产酶系至关重要，目前所用的酶系大多来自大肠杆菌或酵母的GSHⅠ和GSHⅡ，这类酶对氨基酸有很强的亲和力，但GSHⅠ受GSH的抑制严重，这在一定程度上限制了GSH的高产。虽然利用基因工程的手段可以提高GSHⅠ和GSHⅡ的表达量，但仍然无法消除GSH的积累对合成反馈抑制，目前公开发表的文献涉及利用发酵法生产谷胱甘肽的菌种主要为酵母菌，利用酵母菌发酵生产谷胱甘肽具有发酵周期长，产量低的缺陷。
[0004]随着新技术，新工艺的运用，谷胱甘肽产品生产中出现了新的杂质，杂质研究是药品研发的重要内容。欧洲药典将谷胱甘肽产品中4种主要杂质分别命名为A、B、C、D，之后的研究人员将新工艺技术研究中发现的新的产品杂质依序进行命名。申请号为CN 109096367A的专利公开了“一种还原型谷胱甘肽发酵过程中产生的杂质G的分离方法及其用途”，将谷胱甘肽产品生产中产生的杂质谷胱丙肽命名为杂质G。
[0005]自2005年来，陆续有报道发现一种同时具有γ
‑
GCS及GS活性可催化合成谷胱甘肽两步反应的双功能酶GshF，这种酶主要分布于部分革兰氏阳性菌中，大多数对GSH的反馈抑制不敏感，因此有极大的潜力应用于GSH的高产。已有报道使用重组大肠杆菌表达双功能酶
用于谷胱甘肽的发酵，GSH的最高产量达到15 g/L，远超其他文献报道，具有非常高的应用前景。利用发酵法进行GSH生产，葡萄糖及淀粉经过一系列生物代谢产生丙酮酸进入三羧酸循环，中间产物及产生的ATP用于GSH的合成，丙酮酸是一种重要的中间代谢产物，其在转氨酶的催化下形成丙氨酸，故丙氨酸在微生物体内具有较高的浓度水平；其次GSH双功能酶的专一性较低，因此在生物发酵过程及生物催化过程中，部分甘氨酸被丙氨酸替代生成谷胱丙肽，谷胱丙肽是利用双功能酶合成谷胱甘肽产品中的一种重要杂质，在发酵法生产的产品中具有较高的浓度水平。
[0006]目前谷胱甘肽中杂质都是制备产物后进行分离，主要有以下几种。铜盐法：早期GSH分离最常用的一种，该法有很大的实用价值，是目前进行工业化生产所采用的主要工艺；离子交换法：GSH的等电点为5.93，在pH低于5.93的溶液中，GSH会带正电荷，此时可与阳离子交换树脂相互作用，调整各种工艺条件，即可将GSH分离，但是树脂活化需要大量的酸碱，且产品纯度较低，不利于工业化推广；有机汞亲和层析：GSH中的巯基与汞有很强的亲和作用，因此用含汞树脂分离GSH可收到良好的效果，用合成汞树脂进行亲和层析分离GSH，回收率可达到82.96%，但此法会造成汞污染，不利于大规模应用；双水相法：主要是基于双水相分配技术来分离GSH，梅乐和等采用双水相分配结合温度诱导实现了GSH的分离，总萃取率在80%以上，此方法由于设备昂贵等原因，目前还处于试验阶段。
[0007]而工业生产中主要采用铜盐法进行谷胱甘肽的分离，其原理是利用亚铜离子对谷胱甘肽巯基的专一亲和性进行分离纯化，但谷胱丙肽也具有巯基，铜盐法去除谷胱丙肽杂质的分离效果不佳。目前市场谷胱甘肽产品晶型为α晶型，一般是在水
‑
溶媒结晶体系，低温条件下结晶得到的，谷胱丙肽与谷胱甘肽结晶性质及其接近，结晶产品中谷胱丙肽的残留量较高，需要多次结晶或多种技术手段结合才能够达到质量要求。生物法生产谷胱甘肽，谷胱丙肽杂质的有效控制成为了影响谷胱甘肽产品质量的瓶颈。

技术实现思路

[0008]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种还原型谷胱甘肽的制备方法。本专利技术构建表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21进行生物发酵制备还原型谷胱甘肽；再通过改变碳源减少了谷胱甘肽制备过程中杂质的产生，再结合铜盐法提取、β结晶将杂质G完全去除，得到纯度更高的晶型为α晶型的谷胱甘肽产品。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种还原型谷胱甘肽的制备方法，所述制备方法为：（1）对表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21进行培养，中后期流加葡萄糖溶液作为碳源，OD600为20
‑
70时进行诱导，诱导结束添加氨基酸，同时以苹果酸钠/甘氨酸溶液替换葡萄糖作为碳源，进行发酵，对发酵体系进行超滤，滤液用铜盐法进行分离，得到谷胱甘肽溶液；（2）谷胱甘肽溶液进行浓缩、结晶得到β晶型产品；对β晶型产品重新溶解，进行晶型转化得到α晶型产品。
[0010]优选的，步骤（1）中，所述表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21是将KANA基因和gshF基因插入到质粒pUC18中构建重组表达载体pUC18
‑
KANA
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gshF，然后将重组表达载体pUC18
‑
KANA
‑
gshF导入大肠杆菌BL21得到的。
[0011]优选的，步骤（1）中，所述培养的温度为37℃，时间为20
‑
26 h。
[0012]培养表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21的培养基为（每L）：Na本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种还原型谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：（1）对表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21进行培养，中后期流加葡萄糖溶液作为碳源，OD600为20
‑
70时进行诱导，诱导结束添加氨基酸，同时以苹果酸钠/甘氨酸溶液替换葡萄糖作为碳源，进行发酵，对发酵体系进行超滤，滤液用铜盐法进行分离，得到谷胱甘肽溶液；（2）谷胱甘肽溶液进行浓缩、结晶得到β晶型产品；对β晶型产品重新溶解，进行晶型转化得到α晶型产品。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21是将KANA基因和gshF基因插入到质粒pUC18中构建重组表达载体pUC18
‑
KANA
‑
gshF，然后将重组表达载体pUC18
‑
KANA
‑
gshF导入大肠杆菌BL21得到的。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述培养的温度为37℃，时间为20
‑
26 h。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖溶液的浓度为45%
‑
60% ；所述葡萄糖溶液的加入量占培养基体积的25%
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35%；所述诱导的时间为2
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5h。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：于海勤，韦建国，王德正，魏正华，庞保航，孟中英，
申请(专利权)人：山东睿鹰制药集团有限公司，
类型：发明
国别省市：