低成本木质纤维素糖化培养基的制备及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种低成本木质纤维素糖化培养基的制备方法，所述糖化培养基由下述组份组成：磷酸盐0.6

【技术实现步骤摘要】
低成本木质纤维素糖化培养基的制备及应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及微生物的低成本培养方法，具体涉及一种木质纤维素糖化菌的低成本培养方法。

技术介绍

[0002]随着全球能源需求的持续增加，以及环境污染对人类健康威胁的日益加剧，各国对可再生能源的研发和利用愈来愈重视。木质纤维素是自然界中储量最大的生物质原料，实现木质纤维素到生物基化学品和能源的高效生物转化，不仅能可持续性地缓解日益严峻的化石能源危机，还能有效地规避农林废弃物不当处理造成的环境污染，因此符合国家发展绿色循环经济的要求。然而，由于木质纤维素的结构和组成复杂，生物转化的难度较大；最大瓶颈莫过于纤维素结晶区难降解、导致酶解效率低，导致生物转化的成本一直居高不下。为了实现木质纤维素的高效利用，当务之急是实现木质纤维素底物的高效水解糖化。
[0003]由于木质纤维素组分结构复杂，形成强大的天然抗降解屏障，导致其直接利用的效率低。所以，需要清洁高效的木质纤维组分分离技术打破其强大的抗降解屏障，同时根据不同组分特性开发相应的转化路径。其中，纤维素组分利用的关键在于到可发酵糖的转化，这主要依赖高效酶制剂或者生物催化剂的开发。在近几十年时间里，国内外对纤维素酶的研究仍集中在真菌来源的游离纤维素酶体系。专利技术专利ZL201810939329.2、ZL201810939479.3提出了一种新型木质纤维素糖化方法，主要利用热纤梭菌等高温纤维素降解菌为全细胞催化剂，并不采用传统的游离酶制剂方案，不仅通过原位厌氧全细胞糖化显著降低秸秆糖生产成本，还通过下游联产获得多样化的规模推广通道。专利技术专利ZL201810939294.2、ZL201810939182.7、ZL201810939517.5、ZL201810939181.2、ZL201810939518.X等进一步明确了这种木质纤维素糖化方法可以与下游的发酵技术配合使用。
[0004]上述木质纤维素全细胞糖化方法的关键，在于全细胞催化剂的培养；其培养成本也是糖化过程的主要成本。为了解决这一问题，专利技术专利ZL201810039803.6中提出利用硫化钠替换半胱氨酸、利用玉米浆替换酵母粉的技术方案。虽然该专利技术一定程度上降低了培养基的成本，但其培养成本仍过高，难以应用于产业化生产。专利技术专利202210645871.3通过在培养体系中添加二氧化碳、碳酸氢铵以及减少还原性硫化物的方式进一步优化了培养基，实现糖化效率提高。但该方法的培养基易产生沉淀，主要是由于玉米浆中的成分与金属离子等反应造成，且该磷酸盐用量仍较大，特别是采用磷酸钾盐成本较高，而进一步简化培养基成分会导致培养基更易产生沉淀，影响糖化效果的鲁棒性。
[0005]综上可知，在不影响甚至促进糖化效率的前提下降低成本，是培养基优化中亟待解决的技术问题。目前尚未有相关报道。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中木质纤维素全细胞糖化方法难以兼顾培养成本、糖化效率的现
状，本专利技术提供了一种低成本木质纤维素糖化培养基的制备方法。采用本专利技术所述方法制备的木质纤维素糖化培养基，不但成本低廉，而且糖化效率高，具有重要的实际应用价值。
[0007]本专利技术的技术方案：一种低成本木质纤维素糖化培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)配置磷酸盐
‑
硫化钠溶液：称取磷酸盐0.6
‑
3.9重量份，硫化钠0.5重量份，加入适量水至二者溶解，通氮气除氧，高温灭菌。所述的磷酸盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠中的一种或两种。
[0009](2)配置碳酸氢铵溶液：称取碳酸氢铵0.5
‑
1.4重量份，加入适量水至其溶解，过滤灭菌。
[0010](3)配置金属离子母液：称取亚铁盐0.125重量份、钙盐15重量份和镁盐100重量份，溶解于1000体积份水中，通氮气除氧，高温灭菌。所述的亚铁盐为硫酸亚铁或氯化亚铁，所述的钙盐为氯化钙，所述的镁盐为氯化镁。
[0011](4)配制玉米浆体系：将2.5
‑
5重量份玉米浆粉溶解于800体积份水中，调节pH值至中性，离心去除沉淀，加入60
‑
100重量份纤维素碳源，通氮气除氧，高温灭菌。所述的纤维素碳源为预处理后的木质纤维素底物。所述的预处理具体为：对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于10％，半纤维素含量不高于20％的木质纤维素底物，用水清洗至pH不高于8.0。其中，所述木质纤维素底物是秸秆、木糖渣、甘蔗渣、棕榈粕和木薯渣中一种或几种的混合，所述碱法采用1％
‑
5％质量分数氢氧化钠或氢氧化钾在120
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160度反应0.5
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2小时，液固比范围2:1到10:1；所述氨水法采用10％
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25％质量体积分数氨水在120
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160度反应0.5
‑
2小时，液固比范围2:1到10:1。
[0012](5)将步骤(1)、(2)配制的溶液在厌氧条件下加入步骤(4)制备的玉米浆体系中，再加入步骤(3)中配制的金属离子母液10体积份，最后加水至1000体积份，混合均匀；即得到所述的低成本木质纤维素糖化培养基。本专利技术所述的制备方法，采用先对不同组分间复配或单独制备灭菌，然后在使用前再混合的方式。与现有技术中通常采用的混合后灭菌的方法制备的培养基相比，本专利技术制备的培养基显著提高了成分的稳定性，进而实现了糖化效果的提升，产生了意料不到的技术效果。
[0013]采用前述方法制备得到的木质纤维素糖化培养基，所述糖化培养基适用的菌株为表达葡萄糖苷酶的热纤梭菌，尤其适用于通过同源重组将葡萄糖苷酶表达基因整合到基因组上的热纤梭菌。所述糖化培养基由下述组份组成：磷酸盐0.6
‑
3.9g/L，氯化镁1g/L，碳酸氢铵0.5
‑
1.4g/L，亚铁盐1.25mg/L，氯化钙0.15g/L，硫化钠0.5g/L，玉米浆2.5
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5g/L，纤维素碳源60
‑
100g/L；所述培养基的pH值7.0
‑
8.0。与现有技术相比，本申请中的磷酸盐，可以只采用价格相对较低的磷酸二氢钾，或者磷酸二氢钾与磷酸氢二钠的混合，即可实现糖化效果，避免了使用价格昂贵的磷酸氢二钾(磷酸二氢钾的两倍价格)从而显著降低培养基成本。此外，本申请利用碳酸氢铵替代尿素作为氮源，不需要添加柠檬酸钠等金属螯合剂，且磷酸盐、玉米浆等用量极大减少，也进一步显著降低培养基成本。
[0014]一种木质纤维素低成本全细胞糖化方法，包括下述步骤：
[0015](1)制备种子液：在厌氧条件下，将木质纤维素糖化菌接种于种子培养基中，在55
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65℃的温度条件和150
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200rpm的转速条件下，培养至对数生长中期，得到种子液。所述的木质纤维素糖化菌为表达葡萄糖苷酶的热纤梭菌重组菌株。所述的种子培养基为：磷酸氢二
钾1.2g/L、磷酸二氢钾0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低成本木质纤维素糖化培养基的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)配置磷酸盐
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硫化钠溶液：称取磷酸盐0.6
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3.9重量份，硫化钠0.5重量份，加入适量水至二者溶解，通氮气除氧，高温灭菌；(2)配置碳酸氢铵溶液：称取碳酸氢铵0.5
‑
1.4重量份，加入适量水至其溶解，过滤灭菌；(3)配置金属离子母液：称取亚铁盐0.125重量份、钙盐15重量份和镁盐100重量份，溶解于1000体积份水中，通氮气除氧，高温灭菌；(4)配制玉米浆体系：将2.5
‑
5重量份玉米浆粉溶解于800体积份水中，调节pH值至中性，离心去除沉淀，加入60
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100重量份的纤维素碳源，通氮气除氧，高温灭菌；(5)将步骤(1)、(2)配制的溶液在厌氧条件下加入(4)制备的玉米浆体系中，再加入步骤(3)中配制的金属离子母液10体积份，最后加水至1000体积份，混合均匀；即得到所述的低成本木质纤维素糖化培养基。2.根据权利要求1所述的木质纤维素糖化培养基的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的磷酸盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠中的一种或两种。3.根据权利要求1所述的木质纤维素糖化培养基的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的亚铁盐为硫酸亚铁或氯化亚铁，所述的钙盐为氯化钙，所述的镁盐为氯化镁。4.根据权利要求1所述的木质纤维素糖化培养基的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述的纤维素碳源为预处理后的木质纤维素底物，所述的预处理具体为：对木质纤维素原料进行预处理，得到木质素含量不高于10％，半纤维素含量不高于20％的木质纤维素底物，用水清洗至pH不高于8.0。5.根据权利要求4所述的木质纤维素糖化培养基的制备方法，其特征在于：所述木质纤维素底物是秸秆、木糖渣、甘蔗渣、棕榈粕、木薯渣等农林废弃物中的一种或几种的混合物，所述的预处理为碱法或氨水法。6.根据权利要求5所述的木质纤维素低成本全细胞糖化方法，其特征在于：所述碱法采用1％
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5％质量分数氢氧化钠或氢氧化钾在120
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160度反应0.5
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【专利技术属性】
技术研发人员：崔球，刘亚君，张跃冬，万伟建，
申请(专利权)人：青岛中科潮生生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：