一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法技术

本发明专利技术提供了一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，涉及微生物发酵技术领域。包含以下步骤：菌种活化；摇瓶培养：将活化好的菌株转接至三角瓶的种子培养基中培养，得到种子液A；所述的种子液A转移到种子罐的种子培养基中培养，得种子液B；主发酵罐培养：将种子液B转接入主发酵罐的主发酵罐培养基中，分批补料培养；补料培养基以葡萄糖和甘油作为混合碳源，大豆水解液和玉米浆作为混合氮源，以氨水调节pH，发酵4

【技术实现步骤摘要】
一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法


[0001]本专利技术涉及于微生物发酵
，具体涉及一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法。

技术介绍

[0002]二十二碳六烯酸 (cis
‑
4，7，10，13，16，19
‑
docosahexaenoicacid，简称 DHA，CAS号 ：6217
‑
54
‑
5) 属于多不饱和脂肪酸，具有十分重要的生理功能，是人体自身不能大量合成但又不可缺少的重要营养素。DHA 是人体大脑的主要组成成分之一，主要以磷脂的形式存在，约占脑细胞脂肪酸的 30％左右。DHA 具有抗凝血、抑制血小板凝集和血栓形成的作用，可以预防心肌梗塞等心血管疾病。DHA 是人视网膜组织的重要组成成分， 能促进视神经膜延伸，维持视觉正常功能。DHA 会抑制发炎前驱物质的形成，具有消炎作用。DHA能降低孕妇妊高症的风险，减少产后神经衰弱及抑郁症的发生。DHA 有抑制癌症的作用，能明显抑制肿瘤的产生、成长和转移。
[0003]近年来生产 DHA 的方法主要为发酵法。微生物主要是破囊壶菌、裂殖壶菌等海洋真菌。研究发现海洋微生物裂殖壶菌 (Schizochytrium) 细胞中能积累大量 DHA，而且具有培养周期短和不易受污染等优点，能够克服鱼油资源所面临的种种问题 ；同时裂殖壶菌来源的 DHA 被认证为安全的 DHA 新资源。裂殖壶菌又称裂壶藻，属于真菌门、卵菌纲、水霉目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，单细胞、球形。
[0004]裂殖壶菌(Schizochytrium)作为藻油DHA的主要来源之一，属于异养型微生物，具有生长速度快、易培养、细胞脂肪酸含量高、DHA占比高等优势，已实现工业化生产培养用以提取高品质DHA。
[0005]中国专利技术专利申请CN114561434A公开了一种裂殖壶菌发酵生产EPA和DHA的方法，该方法是以裂殖壶菌为生产菌株，在发酵培养基中添加恩西地平，发酵生产多不饱和脂肪酸。通过激活裂殖壶菌部分ELO/DES途径，提高裂殖壶菌发酵产物中EPA和DHA含量，采用裂殖壶菌工程菌EDG为生产菌株，使发酵产物中EPA含量提高8.73倍，DHA含量提高1.15倍。
[0006]中国专利技术专利申请CN114525312A提供了一种使用裂殖壶菌发酵生产DHA的方法。该方法包括如下步骤：将裂殖壶菌接入发酵培养基中发酵；所述发酵体系中，包括碳源、氮源和无机盐；所述无机盐由磷酸盐和镁盐组成。使用了特定的不额外补充钠/氯离子的发酵培养基进行发酵培养，菌体生长代谢未受到影响，总油得到了明显的提高，同时也有效减少了氯离子对于设备的腐蚀问题。
[0007]但裂殖壶菌生长需要供给足够的碳氮源，目前生产中多使用葡萄糖、酵母抽提物、蛋白胨或单质氨基酸、纯品维生素复合物等进行培养，生产成本高，多用于保健食品，难以在水产养殖中大面积推广使用。

技术实现思路

[0008]本专利技术针对上述问题，提供了一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，采用低成本的甘油代替补料碳源，使用酶解法制备豆粕水解液代替昂贵的酵母抽提物、蛋白质或单质氨基
酸，使用副产玉米浆提供所需部分微量元素及维生素。在保证品质的前提下使生产成本降低了20%
‑
30%，具有极大的推广意义。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术提供了一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，包含以下步骤：1）菌种活化：取保存菌种至斜面试管，静置培养，待菌株长满整个斜面培养基停止培养得到活化好的菌株；2）小体积培养：将步骤1）活化好的菌株转接至小体积培养容器的种子培养基中培养，得到种子液A；3）种子扩大培养：将步骤2）所述的种子液A转移到种子罐的种子培养基中培养，得种子液B；4）主发酵罐培养：将步骤3）所述的种子液B转接入主发酵罐的主发酵罐培养基中，分批补料培养；补料培养基以葡萄糖和甘油作为混合碳源，大豆水解液和玉米浆作为混合氮源，以氨水调节pH，发酵4
‑
5d。
[0010]优选地，具体为：1）菌种活化：取
‑
75~
‑
82℃冷冻保存菌种，解冻，无菌条件下，吸取45
‑
55
µ
L至斜面试管，静置培养2
‑
3d，待菌株长满整个斜面培养基停止培养；2）小体积培养：将步骤1）活化好的菌株转接至小体积培养容器的种子培养基中培养2
‑
3d，得到种子液A；3）种子扩大培养：将步骤2）所述的种子液A转移到种子罐的种子培养基中，培养1
‑
2d，得种子液B；4）主发酵罐培养：将步骤3）所述的种子液B转接入主发酵罐的主发酵罐培养基中，分批补料培养；补料培养基以葡萄糖和甘油作为混合碳源，大豆水解液和玉米浆作为混合氮源，以氨水调节pH，发酵4
‑
5d。
[0011]优选地，步骤1）所述的斜面培养基可以包含以下组分：葡萄糖15
‑
22g/L，酵母抽提物3
‑
8 g/L，蛋白胨1
‑
3 g/L，磷酸二氢钾 0.5
‑
1.2g/L，硫酸镁0.2
‑
0.8 g/L，玉米浆0.2
‑
0.8 g/L，琼脂粉10
‑
20g/L 。
[0012]进一步地，步骤1）所述的斜面培养基可以包含以下组分：葡萄糖20g/L，酵母抽提物5 g/L，蛋白胨2 g/L，磷酸二氢钾 1g/L，硫酸镁0.5 g/L，玉米浆0.5 g/L，琼脂粉15g/L 。
[0013]优选地，步骤1）所述的解冻的具体条件可以为35
‑
39℃下在金属浴中解冻。
[0014]优选地，步骤2）和步骤3）所述的种子培养基可以包含以下组分：葡萄糖 10
‑
20g/L，酵母抽提物3
‑
8 g/L，蛋白胨0.5
‑
1.2g/L，大豆水解液3
‑
8g/L，磷酸二氢钾0.5
‑
1.2g/L，硫酸镁 0.3
‑
0.8g/L，硫酸铵1.5
‑
2.3g/L，氯化钙0.4
‑
0.9g/L，碳酸钠0.5
‑
1.4g/L，玉米浆 3
‑
8g/L，海水晶8
‑
15g/L，维生素混合液2
‑
4mL/L，微量元素混合液1
‑
3mL/L。
[0015]进一步地，步骤2）和步骤3）所述的种子培养基可以包含以下组分：葡萄糖 15g/L，酵母抽提物5 g/L，蛋白胨1g/L，大豆水解液5g/L，磷酸二氢钾 1g/L，硫酸镁 0.5 g/L，硫酸铵2g/L，氯化钙0.6 g/L，碳酸钠1 g/L，玉米浆 5g/L，海水晶10g/L，维生素混合液3mL/L，微量元素混合液2mL/L。
[0016]优选地，步骤2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，其特征在于，包含以下步骤：1）菌种活化：取保存菌种至斜面试管，静置培养，待菌株长满整个斜面培养基停止培养得到活化好的菌株；2）小体积培养：将步骤1）活化好的菌株转接至小体积培养容器的种子培养基中培养，得到种子液A；3）种子扩大培养：将步骤2）所述的种子液A转移到种子罐的种子培养基中培养，得种子液B；4）主发酵罐培养：将步骤3）所述的种子液B转接入主发酵罐的主发酵罐培养基中，分批补料培养；补料培养基以葡萄糖和甘油作为混合碳源，大豆水解液和玉米浆作为混合氮源，以氨水调节pH，发酵4
‑
5d。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述的斜面培养基包含以下组分：葡萄糖15
‑
22g/L，酵母抽提物3
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8 g/L，蛋白胨1
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3 g/L，磷酸二氢钾 0.5
‑
1.2g/L，硫酸镁0.2
‑
0.8 g/L，玉米浆0.2
‑
0.8 g/L，琼脂粉10
‑
20g/L 。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）和步骤3）所述的种子培养基包含以下组分：葡萄糖 10
‑
20g/L，酵母抽提物3
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8 g/L，蛋白胨0.5
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1.2g/L，大豆水解液3
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8g/L，磷酸二氢钾0.5
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1.2g/L，硫酸镁 0.3
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0.8g/L，硫酸铵1.5
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2.3g/L，氯化钙0.4
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0.9g/L，碳酸钠0.5
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1.4g/L，玉米浆 3
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8g/L，海水晶8
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15g/L，维生素混合液2
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4mL/L，微量元素混合液1
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3mL/L。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的小体积培养容器的体积：步骤3）所述的种子罐的体积：步骤4）所述的主发酵罐的体积为1：80
‑
110：900
‑
1100。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的种子培养基的体积：小体积培养容器的体积为1：4
‑
5；步骤3）所述的种子培养基的体积：种子罐的体积为1：400
‑
500。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）所述的主发酵罐培养基的体积：主发酵罐体积为2
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴春峰，孙明宾，张新刚，王国峰，孙延松，王萌，
申请(专利权)人：烟台泓源生物肥料有限公司，
类型：发明
国别省市：