一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻DHA含量和产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻DHA含量和产量的方法。该方法具体包括：1)以平板涂布活化裂壶藻，以种子培养基培养裂殖藻到对数期，收集藻液作为发酵用种子液；2)以DHA含量为指标，先优化发酵培养基中DA

【技术实现步骤摘要】
一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻DHA含量和产量的方法


[0001]本专利技术涉及藻类生物
，更具体地说，是一种用2种合成植物生长调节剂协同提高裂壶藻DHA含量和产量的方法。

技术介绍

[0002]DHA作为一种具有多种特殊生理功能的营养物质，对人体心血管健康、大脑发育及视力保健等发挥着重要的作用，在医药和食品行业具有广泛的应用前景。DHA传统来源是深海鱼油，随着海洋资源的日益枯竭，且从深海鱼油中提取DHA具有成本高、腥味重、胆固醇高等缺点，因此需要寻找可持续生产DHA的替代资源，当前利用生物发酵法合成DHA既环保又可再生和人为调控，已成为当前研究热点。
[0003]裂壶藻(Schizochytrium)，是属于真菌门、卵菌纲、水霉目、破囊壶菌科的一类海洋真菌。裂壶藻具有生长周期短、不占用耕地、养殖不受季节气候影响，且藻油DHA含量高、而备受关注，被认为是具有实现DHA的可持续商业化生产的潜力菌株之一。目前有许多策略促进裂壶藻中DHA积累，非生物胁迫(低温、营养成分缺乏、高盐等)是促进DHA含量提高的常用策略，但非生物胁迫使裂壶藻生物量显著降低，致使裂壶藻的DHA产量提高并不显著。植物生长调节剂为人工合成的植物激素类似物，具有调控植物的生长过程和细胞活性的功能。中国专利技术CN 102304479 A研究证实植物激素能促进裂壶藻DHA含量和产量增加，然而，DHA的含量并不高，不利于产业化生产。

技术实现思路

[0004]针对现有策略对裂壶藻中DHA含量和产量提升能力不足，不利于产业化生产的技术问题，本专利技术提供一种用2种合成植物生长调节剂协同提高裂壶藻DHA含量和产量的方法，在裂壶藻发酵培养时同时添加2种植物生长调节剂己酸二乙胺基乙醇酯(DA
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6)和2,4
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二氯萘氧乙酸(2,4
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D)，发挥良好的协同作用，促进裂壶藻中DHA积累，提高DHA的含量和产量。
[0005]为了上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0006]一种用2种合成植物生长调节剂协同提高裂壶藻DHA含量和产量的方法，包括如下步骤：
[0007](1)以平板涂布活化裂壶藻，以种子培养基培养裂壶藻到对数期，收集藻液作为种子培养液接种至发酵培养基；
[0008](2)裂壶藻在添加了0～1.0mg/L DA
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6的发酵培养基中发酵培养，以DHA含量为指标，确定DA
‑
6的最佳添加浓度；
[0009](3)继续以DHA含量为指标，以步骤(2)确定的DA
‑
6浓度为基础，确定2,4
‑
D的最佳添加浓度，构建2种合成植物生长调节剂协同诱导裂壶藻DHA积累、提高DHA含量和产量的稳定培养体系。
[0010]进一步地，裂壶藻采用的种子培养基的配方为：葡萄糖25.00～35.00g/L，酵母粉4.00～12.00g/L，海水晶15.0～25.00g/L；发酵培养基的配方为：葡萄糖50g/L～100g/L，酵母粉5g/L～30g/L，氯化钠0.1g/L～1g/L，硫酸钾0.5g/L～5g/L，磷酸二氢钾0.1g/L～1g/L，结晶硫酸镁1g/L～10g/L，无水氯化钙0.01g/L～1g/L。
[0011]进一步地，所述的平板涂布活化裂壶藻具体为：裂壶藻藻种涂布于平板上活化48
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72小时，挑取所得单菌落藻株转接至种子液培养基中，于温度为25～30℃，转速为150～200rpm的摇床中培养24～48小时至对数期获得种子培养液，用于接种到发酵培养基用。
[0012]进一步地，培养用的容器为挡板三角瓶。
[0013]进一步地，种子培养液以2％～10％的接种比例接种到含有0～1.0mg/L DA
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6的发酵培养基中，于温度为25～30℃，转速为150～200rpm的摇床中培养48～120小时，收集藻液离心分离获得裂壶藻藻泥，藻泥冷冻干燥后，气相色谱法测定裂壶藻中DHA含量，采用内标标准曲线法计算DHA含量。以最高DHA含量确定DA
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6最佳添加浓度。
[0014]进一步地，步骤(3)具体为：在确定DA
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6浓度的基础上，添加0～2.0mg/L的2,4
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D，再以2％～10％的接种比例接种种子培养液，然后于温度为25～30℃，转速为150～200rpm的摇床中培养48～120小时，收集藻液离心分离获得裂壶藻藻泥，藻泥冷冻干燥后，气相色谱法测定裂壶藻中DHA含量，采用内标标准曲线法计算DHA含量。以最高DHA含量确定2,4
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D的最佳协同浓度。
[0015]进一步地，裂壶藻藻粉经皂化和甲酯化后，饱和氯化钠和正己烷萃取DHA，气相色谱法测定DHA的含量，采用内标标准曲线法计算DHA含量。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0017]现有促进裂壶藻DHA含量和产量的策略有非生物胁迫、增加氧溶解量、添加植物生长调节剂等。常用的非生物胁迫策略虽提高DHA积累但会抑制裂壶藻生长，从而使DHA产量提升受到限制，增加溶解氧量需要相应的设备而使养藻成本增加。本专利技术通过添加合成植物生长调节剂能够显著提高裂壶藻DHA含量和产量，且植物生长调节剂使用剂量小，添加到培养基简单方便，合成的植物生长调节剂生产成本低。专利技术人通过研究和分析，意外发现，DA
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6和2,4
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D这2种植物生长调节剂以适当浓度配合使用，能够发挥明显的协同作用，相比使用单一植物生长调节剂，裂壶藻的DHA含量和产量提高倍数明显更大。因此，本专利技术通过添加2种合成植物生长调节剂协同提高裂壶藻DHA含量和产量，是一种相对比较经济合算的策略，更符合工业生产需求。
附图说明
[0018]图1为不同浓度DA
‑
6对裂壶藻中DHA含量和产量的影响。
[0019]图2为不同浓度2,4
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D对裂壶藻中DHA含量和产量的影响。
[0020]图3为0.05mg/L DA
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6协同不同浓度2,4
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D对裂壶藻中DHA含量和产量的影响。
[0021]图4为0.05mg/L DA
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6协同0.5mg/L 2,4
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D与单独添加0.05mg/L DA
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6、0.5mg/L 2,4
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D和不添加植物生长调节剂时裂壶藻中DHA中含量和产量的比较。
具体实施方式
[0022]本专利技术提出了一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻DHA含量和产
量的方法。为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清晰明了，下面通过具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术并不限于此。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻DHA含量和产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以平板涂布活化裂壶藻，以种子培养基培养裂壶藻到对数期，收集藻液作为种子培养液接种至发酵培养基；(2)裂壶藻在发酵培养基中发酵培养，添加0～1.0mg/L DA
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6，以DHA含量为指标，确定DA
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6的最佳添加浓度；(3)继续以DHA含量为指标，以步骤(2)确定的DA
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6浓度为基础，确定2,4
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D的最佳添加浓度，构建2种合成植物生长调节剂协同诱导裂壶藻DHA积累、提高DHA含量和产量的稳定培养体系。2.根据权利要求1所述的一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻DHA含量和产量的方法，其特征在于：种子培养基的配方为葡萄糖25.00～35.00g/L，酵母粉4.00～12.00g/L，海水晶15.0～25.00g/L；发酵培养基的配方为葡萄糖50g/L～100g/L，酵母粉5g/L～30g/L，氯化钠0.1g/L～1g/L，硫酸钾0.5g/L～5g/L，磷酸二氢钾0.1g/L～1g/L，结晶硫酸镁1g/L～10g/L，无水氯化钙0.01g/L～1g/L。3.根据权利要求1所述的一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻DHA含量和产量的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：裂壶藻藻种涂布于平板上活化48
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72小时，挑取所得单菌落藻株转接至种子培养基中培养24～48小时至对数期得到种子培养液。4.根据权利要求1所述的一种用2种合成植物生长调节剂协同诱导提高裂壶藻DHA含量和...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐裕芳，杨雨欣，曾彦霖，李玉芹，周蓉，
申请(专利权)人：湘潭大学，
类型：发明
国别省市：