一种用于β-CTX检测的抗体、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于β

【技术实现步骤摘要】
一种用于
β
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CTX检测的抗体、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及体外诊断试剂、生物工程技术和医疗器械交叉领域，具体而言，涉及一种用于β
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CTX检测的抗体、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]骨转换，是破骨细胞不断吸收旧骨和成骨细胞不断形成新骨的自我更新过程，只有当骨组织不断进行骨塑建和骨重建，才可以维持骨骼生长和结构完整。骨转换对于修复骨骼疲劳损伤和维持机体矿物质平衡至关重要。骨转换生化标志物或骨转换标志物(bone turnover markers，BTMs)是骨转换过程中产生的代谢产物或酶类，分为骨形成指标和骨吸收指标，前者反映成骨细胞活性及骨形成状态，后者代表破骨细胞活性及骨吸收水平。BTMs浓度对于多种骨骼疾病的诊断与鉴别、骨折风险预测、药物疗效评价等具有重要参考价值。近年来，随着骨质疏松症和代谢性骨病的研究进展，特别是国内外BTMs的循证医学证据不断涌现，BTMs的临床应用日趋广泛。
[0003]目前广泛应用的BTMs包括β
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CTX、P1NP、OC和b
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ALP，国内主要临床应用的是β
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CTX、P1NP、OC、ALP。其中，β
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CTX(β
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Cross laps)是目前国际上公认的代表骨吸收标志物。β
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CTX是一种由8个氨基酸组成的I型胶原分解片段，由C端肽的α
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天冬氨酸转变成β型而形成。血清β
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CTX水平的增高表明患者的骨吸收程度增加，骨吸收抑制治疗后血清β
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CTX水平会恢复正常。由于昼夜节律和食物的影响，β
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CTX水平在不同时间段会显示出显著的变化，可以通过在早上禁食状态下的标准化样本收集最小化检测差异。
[0004]在研究和临床实践中，β
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CTX测量的大多数应用都是在血液样本上进行的。血清和血浆β
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CTX方法的特异性差异导致了标准化β
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CTX商业测定的困难。另一方面，现有的检测手段存在诸多缺陷，如检测成本较高、灵敏度较低等。在国内，β
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CTX检测临床上主要以罗氏公司试剂应用为主，但试剂价格昂贵，并不利于在基层普及。因此，有待开发一种灵敏度高、特异性强、检测范围宽、检测效率高的β
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CTX检测试剂盒，用于监测骨质疏松症或其他骨疾病的抗吸收治疗疗效。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的问题是开发一种灵敏度高、特异性强、检测范围宽、检测效率高的β
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CTX检测试剂盒，用于监测骨质疏松症或其他骨疾病的抗吸收治疗疗效。
[0006]为解决上述问题，本专利技术第一方面提供一种用于β
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CTX检测的抗体。
[0007]本专利技术所述的用于β
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CTX检测的抗体为采用杂交瘤细胞生产的单克隆抗体，其制备步骤为：
[0008]抗原合成：在如SEQ ID No.1所示的多肽序列的多肽基础上偶联大分子载体蛋白，所述大分子载体蛋白为BSA、OVA中的一种或多种，制备出具有抗原性和免疫原性的重组免疫原；
[0009]SEQ ID No.1：Cys Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg；
[0010]单独的多肽其分子量通常过小不足以激起充分的免疫反应，而当多肽与带有很多抗原表位的载体蛋白诸如KLH、BSA、OVA进行偶联后，重组抗原相较于多肽，更加有利于刺激后续实验中小鼠的T
H
细胞，进而诱导B淋巴细胞产生免疫反应。
[0011]动物免疫：使用前述大分子载体蛋白制备的重组免疫原和佐剂，通过皮下注射对小鼠进行首次免疫，首次免疫后进行加强免疫，最后一次加强免疫后进行不加佐剂的腋下注射冲击免疫；
[0012]动物免疫利用的是生物体自身的体液免疫应答机制，通过抗原的持续刺激先后启动初级免疫反应和次级免疫反应，实际操作中以血清中抗体效价来衡量实际免疫效果。抗原刺激机体后启动初级反应一般会有一个滞后期，此时幼B细胞经过克隆筛选、增殖，然后分化成记忆细胞或浆细胞；经过滞后期，血清效价呈指数增长达到一个峰值然后下降；初级免疫反应中，会首先分泌IgM，然后经过抗体亚型转换，IgG比例会升高，次级免疫反应的启动依赖于记忆B细胞和记忆T细胞的数目，记忆细胞再次遇到相同抗原就能被激活，从而导致次级免疫反应的发生；当记忆细胞数目远大于幼B细胞时，次级反应启动更快、强度更大；次级反应相比初级反应滞后期更短，浆细胞和血清效价的峰值更高，持续时间更长；同时，此时分泌的抗体经过亲和力成熟和亚型转换，质量更高；进行动物免疫时需要用到佐剂，佐剂的作用主要是延缓抗原的释放，增强吞噬细胞的吞噬和对抗原的呈递。
[0013]细胞融合：提取前述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行混合，加入PEG，诱导细胞进行细胞融合；
[0014]PEG是人工合成药物，在细胞融合中有如下作用：使细胞凝结；破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打和的双核或多核融合细胞。
[0015]单克隆抗体制备：SEQ ID No.1所示的多肽
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OVA偶联物和SEQ ID No.2所示多肽的OVA偶联物以1μg/ml包被，间接法ELISA检测挑选双阳性克隆，经过亚克隆，确保形成单克隆时扩大培养，纯化得单克隆抗体；
[0016]SEQ ID No.2：Cys Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg；
[0017]抗体标记：将单克隆抗体与生物素进行混匀、反应后获得生物素标记的单克隆抗体；
[0018]抗体标记是指将标记物共价连接到抗体上，与待检测物特异性反应形成多元复合物，并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定，生物素都可与蛋白质、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂。一个抗体分子可偶联数个生物素分子，而生物素分子又可与酶或荧光素结合，从而组成一个生物放大系统，显著提高检测的灵敏度。
[0019]抗体配对筛选：将未标记的单克隆抗体孵育包被、封闭，加入SEQ ID No.2所示多肽的多肽
‑
OVA偶联物进行孵育，加入生物素标记的单克隆抗体，孵育，加入SA
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HRP孵育显色，检测，挑选特异性强和灵敏度高的阳性配对。
[0020]通常情况下，一个抗原分子拥有多个抗原决定簇，将抗原注射入动物体内进行免疫，针对不同的抗原决定簇会产生不同的抗体。产生的抗体具有特异性与专一性，即一个抗体分子只会特异性地结合一个抗原决定簇，两个针对不同抗原决定簇的抗体，有可能同时
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
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CTX单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：抗原合成：在如SEQ ID No.1所示的多肽序列的多肽基础上偶联大分子载体蛋白，所述大分子载体蛋白为BSA、OVA中的一种或多种，制备出具有抗原性和免疫原性的重组免疫原；SEQ ID No.1：Cys Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg；动物免疫：使用前述大分子载体蛋白制备的重组免疫原和佐剂，通过皮下注射对小鼠进行首次免疫，首次免疫后进行加强免疫，最后一次加强免疫后进行不加佐剂的腋下注射冲击免疫；细胞融合：提取前述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行混合，加入PEG，诱导细胞进行细胞融合；单克隆抗体制备：SEQ ID No.1所示的多肽
‑
OVA偶联物和SEQ ID No.2所示多肽的OVA偶联物以1μg/ml包被，间接法ELISA检测挑选双阳性克隆，经过亚克隆，确保形成单克隆时扩大培养，纯化得单克隆抗体；SEQ ID No.2：Cys Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg；抗体标记：将单克隆抗体与生物素进行混匀、反应后获得生物素标记的单克隆抗体；抗体配对筛选：将未标记的单克隆抗体孵育包被、封闭，加入SEQ ID No.2所示多肽的多肽
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OVA偶联物进行免疫反应，清洗后加入生物素标记的单克隆抗体，清洗后加入SA
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HRP孵育显色，450nm处读取OD值，挑选特异性强和灵敏度高的阳性配对。2.一种用于β
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CTX检测的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述β
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CTX抗体制备方法制得的单克隆抗体。3.如权利要求2所述的用于β
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CTX检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为包括发光试剂、固相试剂、标准品以及质控品的化学发光免疫试剂盒。4.如权利要求3所述的用于β
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CTX检测的试剂盒，其特征在于，所述固相试剂为包被有β
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CTX单克隆抗体的磁微粒混悬液，磁微粒浓度为0.05
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0.5μg/ml。5.如权利要求4所述的用于β
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CTX检测的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒为具有活性化学基团的超顺磁性纳米磁性微球，其表面活性基团为羧基、甲苯磺酰基、环氧基、氨基中的任意一种。6.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹继华，张华杰，贾江花，李富勇，潘碧莹，姜敏杰，
申请(专利权)人：美康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：