一种生产苏氨酸的重组微生物及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及微生物工程技术领域，具体涉及一种生产苏氨酸的重组微生物及其构建方法和应用。本发明专利技术通过构建乙酸激酶失活的菌株并将其应用于苏氨酸生产，显著提高了菌株生产苏氨酸的能力，结合苹果酸醌氧化还原酶、葡萄糖

【技术实现步骤摘要】
一种生产苏氨酸的重组微生物及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及微生物工程
，具体涉及一种生产苏氨酸的重组微生物及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]苏氨酸(Threonin)的化学名称为β
‑
羟基
‑
α
‑
氨基丁酸，分子式为C4H9NO3，相对分子质量为119.12，是一种必需氨基酸，主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。
[0003]谷氨酸棒杆菌是氨基酸发酵的重要生产菌。谷氨酸棒杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需要五步催化反应，分别由天冬氨酸激酶(lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrB编码)以及苏氨酸合酶(thrC编码)催化。目前利用谷氨酸棒杆菌生产苏氨酸的报道主要集中在其合成路径中，已有抗反馈抑制的hom基因(Reinscheid D J,Eikmanns B J,Sahm H.Analysis of a Corynebacterium glutamicum hom gene coding for a feedback
‑
resistant homoserine dehydrogenase.[J].Journal of Bacteriology,1991,173(10):3228
‑
3230.)、lysC基因(Eikmanns B J,Eggeling L,Sahm H.Molecular aspects of lysine,threonine,and isoleucine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum.[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1993,64(2):145
‑
163.)的报道。但是，目前极少有关于苏氨酸的前体供应和苏氨酸合成过程中丙酮酸的代谢溢流的代谢工程改造的报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是通过失活乙酸激酶使菌株生产苏氨酸的能力得到提升，从而提供一种生产苏氨酸的重组微生物及其构建方法和应用。
[0005]目前关于利用谷氨酸棒杆菌合成苏氨酸的代谢工程改造主要集中在苏氨酸的合成路径，主要为草酰乙酸到苏氨酸的合成路径；而丙酮酸作为微生物代谢网络中重要的中间代谢产物，主要进入三羧酸循环为菌体生长提供能量和前体物质，然而，当上下游代谢通路不平衡时会造成丙酮酸的代谢溢流，从而造成丙酮酸的浪费。虽然苏氨酸的前体是草酰乙酸，但草酰乙酸可以通过丙酮酸羧化酶催化丙酮酸生成，同时也可由丙酮酸进入三羧酸循环经过一系列的酶催化反应生成。本专利技术在苏氨酸的代谢工程研究过程中发现，通过减少丙酮酸的代谢溢流，能够提高丙酮酸向苏氨酸合成前体草酰乙酸的流量，进而促进苏氨酸的合成，而与其它减少丙酮酸代谢溢流的方法相比，降低或丧失乙酸激酶的活性的效果明显更优，通过降低或丧失乙酸激酶的活性能够有效减少丙酮酸代谢溢流，提高苏氨酸合成前体的供应，进而显著提高菌株的苏氨酸合成能力。
[0006]为实现本专利技术的目的，第一方面，本专利技术提供一种修饰的棒状杆菌属微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其乙酸激酶的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。
[0007]优选地，乙酸激酶在NCBI上的参考序列编号为WP_003862874.1，或与其相似性为90％且具有同等功能的氨基酸序列。
[0008]进一步地，所述微生物体内乙酸激酶的活性降低或丧失是通过降低编码乙酸激酶基因的表达或敲除内源的编码乙酸激酶的基因来实现的。
[0009]可以采用诱变、定点突变或同源重组的方法来降低编码乙酸激酶基因的表达或敲除内源的编码乙酸激酶的基因。
[0010]进一步地，所述微生物与未修饰的微生物相比，丙酮酸羧化酶的活性增强和/或解除反馈抑制。
[0011]优选地，丙酮酸羧化酶在NCBI上的参考序列编号为WP_011013816.1，或与其相似性为90％且具有同等功能的氨基酸序列。
[0012]进一步地，所述微生物与未修饰的微生物相比，以下(1)～(4)中的任意一个或多个酶的活性增强和/或解除反馈抑制：
[0013](1)苹果酸醌氧化还原酶；
[0014](2)葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶；
[0015](3)6
‑
磷酸葡糖酸脱氢酶；
[0016](4)NADP依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶。
[0017]优选地，苹果酸醌氧化还原酶、葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶、6
‑
磷酸葡糖酸脱氢酶、NADP依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶在NCBI上的参考序列编号为WP_011014814.1、NP_600790.1、NP_600669.1、FOB93_04945，或与其相似性为90％且具有同等功能的氨基酸序列。
[0018]优选地，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内与苏氨酸合成途径相关的酶的活性增强和/或解除反馈抑制；其中，所述与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶中的至少一种。
[0019]优选地，天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶在NCBI上的参考序列编号为WP_003855724.1、WP_003854900.1、WP_011014964.1，或与其相似性为90％且具有同等功能的氨基酸序列。
[0020]优选地，所述微生物为如下
①
～
⑥
中的任一种：
[0021]①
乙酸激酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和/或苏氨酸合酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
[0022]②
乙酸激酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶和/或丙酮酸羧化酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
[0023]③
乙酸激酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶和/或苹果酸醌氧化还原酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
[0024]④
乙酸激酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶和/或葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
[0025]⑤
乙酸激酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶和/或6
‑
磷酸葡糖酸脱氢酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
[0026]⑥
乙酸激酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶和/或变异链球菌来源的NADP依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物。
[0027]以上所述的酶的活性增强是由选自以下1)～6)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种修饰的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修饰的微生物，其乙酸激酶的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物体内乙酸激酶的活性降低或丧失是通过降低编码乙酸激酶基因的表达或敲除内源的编码乙酸激酶的基因来实现的。3.根据权利要求2所述的微生物，其特征在于，采用诱变、定点突变或同源重组的方法来降低编码乙酸激酶基因的表达或敲除内源的编码乙酸激酶的基因。4.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物与未修饰的微生物相比，丙酮酸羧化酶的活性增强和/或解除反馈抑制；优选地，所述微生物与未修饰的微生物相比，以下(1)～(4)中的任意一个或多个酶的活性增强和/或解除反馈抑制：(1)苹果酸醌氧化还原酶；(2)葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶；(3)6
‑
磷酸葡糖酸脱氢酶；(4)NADP依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶。5.根据权利要求1～4任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内与苏氨酸合成途径相关的酶的活性增强和/或解除反馈抑制；其中，所述与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶中的至少一种。6.根据权利要求5所述的微生物，其特征在于，所述微生物为如下
①
～
⑥
中的任一种：
①
乙酸激酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和/或苏氨酸合酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
②
乙酸激酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶和/或丙酮酸羧化酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
③
乙酸激酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶和/或苹果酸醌氧化还原酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
④
乙酸激酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶和/或葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶活性增强和/或解除反馈抑制的微生物；
⑤
乙酸激酶活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶、丙酮酸羧化酶和/或6
‑
磷酸葡糖酸脱氢酶活性增强和/...

【专利技术属性】
技术研发人员：康培，姚嘉琪，宫卫波，何君，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：