第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法和使用方法技术

本发明专利技术涉及一种第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，包括抗原的制备、免疫、亲和层析柱的制备以及抗体的制备为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在多肽链C末端增加一个L

【技术实现步骤摘要】
第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法和使用方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法和使用方法。

技术介绍

[0002]磷酸化抗体是一种广泛应用于细胞信号转导领域的抗体，其可以特异性地识别蛋白质磷酸化修饰，并用于检测和研究不同的信号通路。
[0003]磷酸化抗原的制备需要先根据所关注的蛋白质确定其磷酸化位置，例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。磷酸化抗原可以通过重组蛋白合成多肽或天然蛋白质进行化学修饰而得到，其中最常见的方式为多肽合成；具体流程如下
[0004]1.根据所需的磷酸化位点确认多肽序列并设计引物
[0005]通过合成机制制备肽链
[0006]合成后需要进行质谱HPLC等检测手段,确认合成多肽的结构和纯度
[0007]使用磷酸化酶将多肽在所需的位点磷酸化或者使用其他方法,如光化学或者人为合成等进行磷酸化修饰
[0008]最后对于磷酸化抗原的纯度和活性进行检测并保存
[0009]磷酸化抗体的制备与传统的抗体制备本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，包括抗原的制备、免疫、亲和层析柱的制备以及抗体的制备，其特征在于，利用Abdesigner软件对PI3Kp85的氨基酸序列进行抗原表位分析，分析内容包括亲水性、抗原性、表面可能性、柔性区评估，同时考虑氨基酸结构复杂程度、易氧化程度、合成难度、氨基酸类别和分布，为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在多肽链C末端增加一个L
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半胱氨酸进行封闭，最终确定PI3Kp85的序列为KLHEY(p)NTQFQE；制备过程中采用两步法亲和纯化，先通过磷酸化层析柱，再通过非磷酸化层析柱做亲和去除。2.根据权利要求1所述的第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，其特征在于，所述抗原的制备包括如下步骤：a.多肽偶联a1.在KLH溶液中加入Sulfo
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SMCC，得到KLH
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SMCC溶液，将KLH
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SMCC溶液用脱盐柱去除游离的Sulfo
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SMCC；脱盐柱用3个柱体积的交联缓冲液平衡，然后上样；待KLH
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SMCC溶液进入胶床后，用交联缓冲液洗脱；通过测定280nm的光吸收值收集KLH
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SMCC所在的蛋白峰液并收集此峰液；合并每次峰收液；a2.用Lowry法测定收集KLH
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SMCC的浓度，根据所测蛋白浓度将KLH
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SMCC按3mg/管分装；a3.加入20mg/ml的多肽溶液反应不少于6小时，再加入L
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半胱氨酸溶液反应数小时；a4.将混合液转移至新处理好的透析袋中，用PBS缓冲液透析，透析完成后收集透析袋中全部内容物，并用PBS冲洗透析袋，收集全部冲洗液；a5.将多肽
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KLH偶联物稀释为1mg/ml并分装，得到多肽
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KLH抗原，低温保存。3.根据权利要求2所述的第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫包括如下步骤：b.抗原乳化b1.用0.01MPBS将多肽
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KLH抗原稀释到1ml/羊；b2.将全部抗原吸入一支乳化用注射器，另一支注射器吸入与抗原液等体积的福氏佐剂；b3.用双联针头将两只注射器连接起来；b4.用力将抗原液快速推入佐剂内，然后反复推拉双联注射器，直至乳化完成；b5.用干净平皿盛满冷水，将乳化好的抗原佐剂混合液滴一小滴到水中，如液滴无扩散现象则说明乳化成功，如有扩散现象，则继续推拉乳化，直至乳化成功；b6.将经检验乳化合格的抗原通过双联针头转到注射用玻璃注射器中，安上针头待用；c.免疫c1.基础免疫：将需免疫的羊从笼子中抓出放在操作台上，皮下注射8－10个部位，每个部位0.3－0.5ml乳化合格的抗原；c2.加强免疫:除背部皮下免疫5个点外，增加注射两个肌肉位点，每个部位注射0.1－0.3ml抗原；c3.血清收集:采集两次检测用血，第一次加强免疫后第七天采集检测血A，第二次加强免疫后七天采集检测血B；第三次加强免疫后七天采集阳性血后留样作为检测血清；c4.将收集的检测血A和检测血B离心后分离血清。
4.根据权利要求3所述的第452位络氨酸磷酸化PI3Kp85抗体的制备方法，其特征在于，所述亲和层析柱的制备包括如下步骤：d.亲和层析柱的制备d1.多肽与SulfolinkGel偶联：从4℃冰箱中取出SulfolinkGel，放置使其达到室温；竖直放好柱子，打开顶盖；一个柱体积交联缓冲液清洗柱子，留少量交联缓冲液于柱子底部，装上底部disc胶固定片；d2.取SulfolinkGel混匀好的悬浮液装入层析柱，至少用20ml交联缓冲液平衡，然后装上层析柱底盖；d3.将溶解好的2mg多肽稀释到2ml交联缓冲液中；d4.将多肽溶液加入层析柱，层析柱采用SulfolinkGel层析柱，在4℃下摇动混匀层析柱反应过夜，次日取层析柱在室温静置数十分钟，按先上后下顺序取下层析柱顶盖与底盖，让层...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟寅秀，杨留才，张虎，田郡，
申请(专利权)人：江苏医药职业学院，
类型：发明
国别省市：