一种超声涡旋振荡联合高效萃取枯草芽孢杆菌中七烯甲萘醌的方法技术

一种超声涡旋振荡联合高效萃取枯草芽孢杆菌中七烯甲萘醌的方法，包括如下步骤：（1）向发酵液中加入正己烷、异丙醇混合液，先进行超声波辅助萃取，剧烈旋涡振荡，之后摇床萃取2 h；（2）在上述发酵液和有机溶剂混合液中加入正丁醇，剧烈振荡,离心，收集有机相，得第一次萃取液；（3）重复步骤（2），得第二次萃取液，合并两次萃取液，以0.22μm孔径有机微孔滤膜过滤，即为发酵液中MK

【技术实现步骤摘要】
一种超声涡旋振荡联合高效萃取枯草芽孢杆菌中七烯甲萘醌的方法


[0001]本专利技术属于维生素K2提取分离
，涉及一种超声涡旋振荡联合高效萃取枯草芽孢杆菌中七烯甲萘醌的方法。

技术介绍

[0002]维生素K2(VitaminK2，简称VK2)是一种天然脂溶性维生素，化学结构式为2
‑
甲基
‑3‑
烯基
‑
1，4
‑
萘醌，分子式为C
16
H
16
O2·
(C5H8)n，是一系列含有2
‑
甲基
‑
1，4
‑
萘醌母核及C3位带有数目不等的异戊二烯结构单元的萜烯侧链化合物的统称，根据异戊二烯侧链数量的不同，维生素K2可以分为14种，通常以MK
‑
n表示，其中n指的是异戊二烯单元的个数。研究表明维生素K2除了可以治疗维生素MK
‑
7缺乏性出血症，促进凝血酶原的形成，加速凝血，维持正常的凝血时间，还能预防和治疗骨质疏松症。维生素K2分子式如下：
[0003][0004]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种革兰氏阳性菌，利用枯草芽孢杆菌发酵制备维生素K2具有原料易得、条件温和、能耗低、安全无毒等优点，而且通过微生物发酵制备的维生素K2均为反式结构，具有更好的生物活性和生物相容性，易被人体吸收和利用。
[0005]维生素K2是一种脂溶性维生素，现有技术大多采用有机溶剂从发酵液中提取维生素K2，常用有机溶剂有乙醇、丙酮、石油氯仿等。例如中国专利CN104328064B使用正己烷、异丙醇等有机溶剂进行萃取，中国专利CN104262129B等利用柱层析设备，使用正己烷、石油醚、丙酮等试剂梯度或等度洗脱对发酵液中的维生素K2进行分离提取。
[0006]根据文献报道，目前用于分离提取枯草芽孢杆菌中维生素K2的方法主要有以下两种：1.固液萃取法：即将固体浸在特定的溶剂中，利用固体中各组分在溶剂中的不同溶解度，使固体中的有效成分从固相转移到液相的过程。Sato等向含维生素K的发酵肉汤中加入丙醇：正己烷混合物(体积比1：2)，剧烈摇动混合物并静置，分离有机层并蒸发，留下维生素K固体残余物，之后用正己烷提取残留物，离心后，使用甲苯：己烷混合物(体积比1：2)通过硅胶柱洗涤所得溶液。最后，通过HPLC分析组分并在真空下蒸发有机溶剂回收MK
‑
7。Gao Q等在对大肠杆菌MK
‑
7生物合成系统进行优化时，在室温下以13000rpm离心收集大肠杆菌细胞，并用蒸馏水洗涤一次，使用正己烷：2
‑
丙醇(体积比2：1)浸提MK
‑
7。2.液
‑
液萃取法：指在液体混合物中加入与其不相混溶(或稍相混溶)的特定溶剂，利用其组分在溶剂中的不同溶解度而达到分离或提取目的。液
‑
液萃取通常用于提取脂溶性代谢物。
[0007]徐行等直接在发酵液中加入异丙醇
‑
正己烷(体积比1:2)，剧烈振荡离心后，取上层有机相，重复萃取三次，得发酵液提取物。Berenjian A等利用纳豆芽孢杆菌生产MK
‑
7时，
在发酵液中加入异丙醇和正己烷的混合物，经剧烈振荡离心后，使有机相和水相分层回收萃取MK
‑
7。
[0008]以上两种常用的萃取MK
‑
7的方法，虽然能得到一定浓度的MK
‑
7，但萃取方法单一，发酵液和萃取剂无法充分接触，影响破壁效果以及MK
‑
7在萃取剂中的溶解度，导致维生素K2萃取不充分，影响MK
‑
7的最终得率。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种超声涡旋振荡联合高效萃取枯草芽孢杆菌中七烯甲萘醌的方法。
[0010]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种超声涡旋振荡联合高效萃取枯草芽孢杆菌中七烯甲萘醌的方法，包括以下步骤：
[0011]步骤1：枯草芽孢杆菌发酵制备七烯甲萘醌的发酵液中加入由正己烷和异丙醇组成的混合液，先进行超声波辅助萃取，旋涡振荡，之后在30
‑
40℃条件下，以搅拌转速200
‑
300r/min萃取1
‑
3h；
[0012]步骤2：向步骤1得到的萃取液中加入正丁醇，1500
‑
2500rpm/min振荡3
‑
8min，然后离心收集有机相，得第一次萃取液；
[0013]步骤3：向步骤2离心后获得的余下物中加入正丁醇，1500
‑
2500rpm/min振荡3
‑
8min，然后离心收集有机相，得第二次萃取液；合并第一次萃取液和第二次萃取液，以0.22μm孔径有机微孔滤膜过滤，获得的滤液即为含有七烯甲萘醌的溶液。
[0014]优选的技术方案为：正己烷和异丙醇的体积比为1.5
‑
2.5：1。
[0015]优选的技术方案为：离心工艺的参数为：4000
‑
6000
×
g离心2
‑
5min。
[0016]优选的技术方案为：超声波频率为10
‑
50KHz，功率为50W
‑
300w；超声时间为5
‑
20min。
[0017]优选的技术方案为：步骤1中，旋涡振荡的工艺参数为：1500
‑
2500rpm/min旋涡振荡5
‑
20min。
[0018]由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有的优点是：
[0019]本专利技术提供了一种高效制备MK
‑
7的方法，无需冷冻干燥设备，加入有机试剂后，利用超声波的促溶和破壁作用结合涡旋震荡进行萃取，具有萃取时间短、步骤简单、萃取率高的优点，极大提高了生产效率。该制备方法制备获得的MK
‑
7纯度高，能够广泛应用于医药、保健品、工业生产等领域。
附图说明
[0020]附图1为超声波和涡旋振荡联合萃取MK
‑
7示意图。
[0021]附图2为传统萃取方法和超声涡旋萃取法流程对比图。
[0022]附图3为传统萃取方法和超声涡旋萃取法萃取发酵液中MK
‑
7产量图。
[0023]附图4为不同超声时间萃取发酵液中MK
‑
7得率图。
[0024]附图5为不同超声波频率萃取发酵液中MK
‑
7得率图。
[0025]附图6为不同超声波功率萃取发酵液中MK
‑
7得率图。
[0026]附图7为不同涡旋振荡时间萃取发酵液中MK
‑
7得率图。
[0027]附图8为不同涡旋振荡转速萃取发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种超声涡旋振荡联合高效萃取枯草芽孢杆菌中七烯甲萘醌的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：枯草芽孢杆菌发酵制备七烯甲萘醌的发酵液中加入由正己烷和异丙醇组成的混合液，先进行超声波辅助萃取，旋涡振荡，之后在30
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40℃条件下，以搅拌转速200
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300r/min萃取1
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3 h；步骤2：向步骤1得到的萃取液中加入正丁醇，1500
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2500rpm/min振荡3
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8min，然后离心收集有机相，得第一次萃取液；步骤3：向步骤2离心后获得的余下物中加入正丁醇，1500
‑
2500rpm/min振荡3
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8min，然后离心收集有机相，得第二次萃取液；合并第一次萃取液和第二次萃取液，以0.22μm孔径有机微孔滤膜过滤，获得的滤液即为含有七烯甲萘醌的溶液。2.根据权利要求1所述的超声涡...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑之明，张瑞，丁秀敏，郑文倩，王鹏，王晗，王丽，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：