靶向CD24和CD47的双特异性抗体融合蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了靶向CD24和CD47的双特异性抗体融合蛋白及其制备方法与应用。本发明专利技术的双特异性抗体融合蛋白包含CD24抗体重链、CD24抗体轻链及CD47

【技术实现步骤摘要】
靶向CD24和CD47的双特异性抗体融合蛋白及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤免疫学领域，具体地说，涉及一种靶向CD24和CD47的双特异性抗体融合蛋白及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病，在各种致死性的疾病中高居第二位。近年来，恶性肿瘤的发病率明显上升，同时，其治疗效果较差，晚期易发生转移，预后不佳。目前临床上，所采用的常规治疗方法如放化疗和手术治疗很大程度缓解了疼痛，但这些疗法的副作用及局限性仍很大，疗效难以进一步提高。
[0003]肿瘤的发生发展是个多因素多机制多种因子参与的过程。CD47即整合素相关蛋白(Integrin
‑
Associated Protein，IAP)，表达于细胞表面，可结合巨噬细胞表面的信号调节蛋白
‑
α(Signal
‑
RegμLatory Proteinα，SIRPα)进而磷酸化SIRPα的胞质内免疫受体酪氨酸抑制性基序(Immunoreceptor Tyrosine
‑
based Inhibition Motifs，ITIMs)，招募磷酸酶SHP
‑
1后向巨噬细胞发出“别吃我”的抑制性信号。CD47分子在肿瘤细胞表面的广泛表达抑制了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬效应。据此，研究人员开发了可激活巨噬细胞吞噬效应的CD47拮抗剂(CD47 antagonists)。CD47拮抗剂将通过封闭CD47和SIRPα结合而激活巨噬细胞的吞噬作用，增强抗肿瘤免疫反应，最终达到抑制肿瘤生长的目的。
[0004]CD24又名热稳定抗原(Heat Stable Antigen,HSA)，是一个含有31个氨基酸的短肽。作为一种细胞黏附分子，CD24的糖基化高度多变且和细胞类型相关，高度糖基化的CD24通过磷脂酰肌醇(Glycosyl
‑
Phoshphatidyl
‑
Inositol，GPI)锚定在细胞膜内的脂质筏上。研究发现CD24在乳腺癌、卵巢癌及肺癌等多种肿瘤细胞表面过表达。它可与巨噬细胞表面表达的抑制性受体Siglec
‑
10结合发出“别吃我”的信号从而限制了巨噬细胞的吞噬作用，这种免疫抑制性信号往往通过和经典的CD47信号互补的方式发挥作用，因此CD24可能是肿瘤免疫治疗的一个新靶点。进一步研究发现，抗CD24的抗体可有效激活巨噬细胞吞噬作用的活性。为此，CD24不仅是一个新发现的免疫检查点，同时也是潜在的抗肿瘤药物作用靶点。另外，研究发现人红细胞表面不表达CD24分子，故CD24靶向药物不存在潜在的血液毒性风险。
[0005]由此可见，如果能同时阻断CD47和CD24，不但可以抑制CD24信号激活导致的肿瘤的侵袭和转移，也将阻断CD47和CD24介导的肿瘤抑制性信号，激活对肿瘤的免疫反应，故可能会比单独阻断CD24或CD47有更好的抑制肿瘤生长增殖的协同作用，对肿瘤的治疗将具有重要意义。
[0006]然而，单抗联合应用具有多方面的限制。首先，临床上应用两种抗体的安全性和效果至今未有详尽的报道，可能存在安全风险；另外，联合应用两种抗体也存在调节障碍和造价太高的缺陷，限制了其临床应用。
[0007]因此，采用基因工程技术构建一个可以同时阻断两个靶点的双特异性抗体融合蛋
白，既能阻断CD24，又能阻断CD47，进而更有效地抑制肿瘤的生长和增殖，成为亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种靶向CD24和CD47的双特异性抗体融合蛋白及其制备方法与应用。
[0009]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种靶向CD24和CD47的双特异性抗体融合蛋白CD47/CD24
‑
BsAb
‑
Ig(记为PPAB001)，所述融合蛋白包含CD24抗体重链、CD24抗体轻链以及CD47
‑
Fc结合肽；
[0010]其中，CD24抗体重链的恒定区与CD47
‑
Fc结合肽的Fc段通过“锁钥结构”连接；
[0011]所述融合蛋白能够同时与CD47、CD24结合。
[0012]进一步地，所述CD24抗体轻链包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，所述CD24抗体重链包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述CD47
‑
Fc结合肽包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
[0013]第二方面，本专利技术提供所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0014]S1、分别构建含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的载体，并将其共转染至宿主细胞中进行培养，筛选稳定表达目标融合蛋白的细胞克隆；
[0015]S2、对细胞培养物进行分离纯化，得到目标融合蛋白。
[0016]进一步地，所述载体可以是真核表达载体pcDNA3.1。
[0017]进一步地，所述宿主细胞可以是CHO
‑
K1细胞。
[0018]进一步地，用含600μg/mL G418和250μg/mL Zeocin的选择培养基筛选稳定表达目标融合蛋白的细胞克隆。
[0019]第三方面，本专利技术提供编码所述融合蛋白的核酸分子。
[0020]第四方面，本专利技术提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
[0021]第五方面，本专利技术提供含有所述融合蛋白的组合物，所述组合物任选包含抗肿瘤制剂。
[0022]所述抗肿瘤制剂选自如下A～E中的至少一种：
[0023]A、细胞毒类药物，包括：(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT
‑
207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂，如6
‑
巯基嘌呤(6
‑
MP)和6
‑
TG等；核苷酸还原酶抑制剂，如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara
‑
C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物，如放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)作用于微管蛋白合成的药物，如紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药，如门冬酰胺酶，主要抑制蛋白质的合成；
[0024]B、激素类药物，包括：(1)抗雌激素，如三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；(2)芳香化酶抑制剂，如氨鲁米特、兰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向CD24和CD47的双特异性抗体融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含CD24抗体重链、CD24抗体轻链以及CD47
‑
Fc结合肽；其中，CD24抗体重链的恒定区与CD47
‑
Fc结合肽的Fc段通过“锁钥结构”连接；所述融合蛋白能够同时与CD47、CD24结合。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述CD24抗体轻链包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，所述CD24抗体重链包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述CD47
‑
Fc结合肽包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。3.权利要求1或2所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、分别构建含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的载体，并将其共转染至宿主细胞中进行培养，筛选稳定表达目标融合蛋白的细胞克隆；S2、对细胞培养物进行分离纯化，得到目标融合蛋白。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述载体为真核表达载体pcDNA3.1。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为CHO
‑
K1细胞。6.根据权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，用含600μg/mL G418和250μg/mL Zeocin的选择培养基筛选稳定表达目标融合蛋白的细胞克隆。7.编码权利要求1或2所述融合蛋白的核酸分子。8.含有权利要求7所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨赟，武贺，张晶，杨妍，周贝，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：