一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法技术

本发明专利技术涉及化学分析定量检测技术领域，具体涉及一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法；一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，步骤如下：向待测血清样本中加入稳定同位素内标溶液进行混合后，加入甲醛、甲基叔丁基醚进行反应，得到预处理后的待测血清样本；将预处理后的待测血清样本采用超高效液相色谱串联质谱法进行检测，并采用稳定同位素内标法定量建立得到的校准曲线计算各种类固醇激素的含量；本发明专利技术公开了一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，用于同时定量多种类固醇激素，并同时检测低容量样本中的微量类固醇激素水平。测低容量样本中的微量类固醇激素水平。测低容量样本中的微量类固醇激素水平。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法


[0001]本专利技术涉及化学分析定量检测
，具体涉及一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法。

技术介绍

[0002]由于工业涂料、杀虫剂、增塑剂、食品添加剂和其它化合物在人类社会中的使用越来越多，人类和动物暴露在那些更容易破坏内分泌系统、影响性分化、生殖、生育和生理稳态的化学物质中。类固醇激素家族作为内分泌系统中的一类信号分子，是病理诊断的重要参考。在这种情况下，其准确测量尤为重要。然而，类固醇激素及其代谢产物的种类繁多及其结构的相似性为定量分析带来了重大的复杂性，此外，它们在生物体中的含量极低，从pg mL
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1到ng mL
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1，多种类固醇激素的快速定量已成为临床医学和实验室检测中公认的挑战。
[0003]实验室分析对具有突出灵敏度和特异性的定量方法提出了很高的要求。目前，免疫测定法如ELISA，酶联免疫吸附测定法，基于色谱的分析方法如GC
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MS，气相色谱和质谱的结合；HPLC
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UV，高效液相色谱和紫外线的结合最常用于常规类固醇激素的定量。用于测定多种内源性类固醇激素的最常见的采样矩阵是血清。然而，对于非洲爪蟾Xenopus laevis、斑蝥Danio rerio或肌肉鼠Mus musculus等模型实验动物来说，很难获得大量血清样本。因此，现有技术中通常使用LC
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MS/MS液相色谱
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质谱法技术进行测定，通过UPLC/>–
MS/MS超高效液相色谱
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串联质谱技术将U/HPLC的高效分离能力与MS的特异性、敏感性、多组分检测和结构分析能力相结合，从而实现类固醇激素的定量检测。UPLC
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MS/MS技术在低浓度范围内表现出更高的特异性和敏感性。此外，UPLC
–
MS/MS具有同时多通道检测的能力，可以用更少的样本量同时测定多种甾体激素，有利于高通量和节省时间。
[0004]对于传统类固醇激素的UPLC
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MS/MS分析，最常用的是正离子或负离子模式的电喷雾电离ESI，例如β
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雌二醇和17α
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乙炔雌二醇可以通过负离子模式下的电喷雾离子化有效电离ESI(
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)；但是对于前体胆固醇CH，它仅适用于使用大气压化学电离APCI源而不是ESI源进行量化，并且物质之间的性质差异使得在利用UPLC
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MS/MS进行检测时，无法实现批量定量。
[0005]因此，需要探索将ESI与ACPI相结合的技术，从而可以实现仅需收集少量动物血清样本，便可在数分钟之内完成内源性类固醇激素的检测的方法。

技术实现思路

[0006]为了实现类固醇生成途径中多种激素的同时定量，本专利技术目的在于提供一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，用于胆固醇(CH)、醛固酮(A)、可的松(E)、氢化可的松(F)、21
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脱氧皮质醇(21
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DF)、皮质酮(B)、11脱氧皮质醇(11
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DF)、雄烯二酮(A2)、雌二醇(E2)、雌酮(E1)、2
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甲氧基雌二醇(2
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MeE2)、21
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羟基孕酮(21
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OHP)、17
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α
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羟基孕酮(17α
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OHP)、睾酮(T)、脱氢表雄酮(DHEA)、孕酮(P4)、二氢睾酮(DHT)和孕烯醇酮(P5)在低容量动物血清样品中的含量。
[0007]第一方面，本申请提供一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的样本预处理方法，采用如下的技术方案：一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的样本预处理方法，所述样本预处理方法的步骤如下：向待测血清样本中加入稳定同位素内标溶液进行混合后，加入甲醛、甲基叔丁基醚进行反应，得到预处理后的待测血清样本。
[0008]优选的，所述样本预处理方法的步骤如下：(1)将待测血清样本与稳定同位素内标溶液进行混合后，加入甲醛混匀；(2)加入甲基叔丁基醚进行萃取后离心，合并有机相，吹干、用乙腈复溶、过滤，即可得到预处理后的待测血清样本。
[0009]优选的，待测血清样本的加入量为100
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120μL；例如待测血清样本的加入量为100μL、103μL、105μL、108μL、110μL、113μL、115μL、118μL或120μL。
[0010]优选的，稳定同位素内标溶液的加入量为5μL。
[0011]优选的，甲醛的加入量为10
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15μL；甲醛为体积浓度为2％的甲醛水溶液；例如甲醛的加入量为10μL、11μL、12μL、13μL、14μL或15μL。
[0012]优选的，甲基叔丁基醚的加入量为200
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250μL；例如甲基叔丁基醚的加入量为200μL、210μL、220μL、230μL、240μL或250μL。
[0013]优选的，加入稳定同位素内标溶液后进行混合的时间为10
‑
20分钟；例如混合的时间为10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟或20分钟。
[0014]优选的，加入甲基叔丁基醚后进行反应的时间为5
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10分钟；例如反应的时间为5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟。
[0015]本申请中加入甲醛、甲基叔丁基醚，通过加入甲醛使血清样本和内标中的类固醇激素从样本转移出来，再由甲基叔丁基醚进行液液萃取，目的是解决体内类固醇激素(如T和E2)与性激素结合球蛋白相结合，从而导致检测浓度低的问题。
[0016]本申请中选用甲醛、甲基叔丁基醚作为前处理物质，利用物质相似相溶的原理，将血清中的类固醇激素转移至有机相中，便于上机检测。
[0017]本申请中加入稳定同位素内标溶液，通过检测其上机的浓度，可以用来衡量整个前处理过程中待测样品实际的损耗，便于计算加标回收率。
[0018]本申请中根据物质的相似相溶性的原理，选择乙腈进行复溶，更易于溶解。
[0019]第二方面，本申请提供一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，采用如下的技术方案：一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的方法，步骤如下：按照上述样本预处理方法制备得到预处理后的待测血清样本；将预处理后的待测血清样本采用超高效液相色谱串联质谱法进行检测，并采用稳定同位素内标法定量建立得到的校准曲线计算各种类固醇激素的含量。
[0020]优选的，色谱条件如下：色谱柱：C18色谱柱；流动相A：0.1mM的氟化铵；流动相B：乙腈；
柱温：45℃；进样量：1μL；采用梯度洗脱程序进行洗脱。
[0021]优选的，液相色谱梯度洗脱程序如下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测动物血清中多种内源性类固醇激素的样本预处理方法，其特征在于，所述样本预处理方法的步骤如下：向待测血清样本中加入稳定同位素内标溶液进行混合后，加入甲醛、甲基叔丁基醚进行反应，得到预处理后的待测血清样本。2.根据权利要求1所述的样本预处理方法，其特征在于，所述样本预处理方法的步骤如下：(1)将待测血清样本与稳定同位素内标溶液进行混合后，加入甲醛混匀；(2)加入甲基叔丁基醚进行萃取后离心，合并有机相，即可得到预处理后的待测血清样本。3.根据权利要求1或2所述的样本预处理方法，其特征在于，步骤如下：待测血清样本的加入量为100
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120μL；稳定同位素内标溶液的加入量为5μL；甲醛的加入量为10
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15μL；甲醛为体积浓度为2％的甲醛水溶液；甲基叔丁基醚的加入量为200
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250μL。4.根据权利要求1或2所述的样本预处理方法，其特征在于：加入稳定同位素内标溶液后进行混合的时间为10
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20分钟。5.根据权利要求1或2所述的样本预处理方法，其特征在于：加入甲基叔丁基醚后进行反应的时间为5
‑
10分钟。6.根据权利要求2所述的样本预处理方法，其特征在于：步骤(2)中还包括对合并的有机相进行吹干、用乙腈复溶、过滤，即可得到预处理后的待测血清样本。7.一种用于检测动物血...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志权，张杭君，张亦南，丁佳锋，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：