一种用于核酸检测、分析的系统技术方案

本发明专利技术涉及C12Q，更具体地，本发明专利技术涉及一种用于核酸检测、分析的系统，包括：微滴发生器、PCR处理器、流式细胞仪。当用于核酸检测时，一般将带有样品的油滴经过PCR扩增后，拍摄荧光图像计数阳性微滴，得到样本的阳性率，但是对于弱阳性微滴，难以进行判断，这一方面是因为在荧光反射成像时噪声的影响，而本发明专利技术通过PCR和流式细胞仪集成，利用流式细胞仪更高的信噪比，促进对弱阳性微滴的分辨，提高检测灵敏度。且本发明专利技术可以使用更小尺寸的微滴，使得微滴的数目增加很多倍，样本阳性率的测试准确性明显提高。性明显提高。性明显提高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于核酸检测、分析的系统


[0001]本专利技术涉及C12Q，更具体地，本专利技术涉及一种用于核酸检测、分析的系统。

技术介绍

[0002]目前核酸检测的主要方法为微滴数字PCR扩增核酸，并添加可以对核酸的特异性核苷酸序列进行识别的荧光探针，通过检测荧光强度是否达到设定阈值来进行核酸检测阳性和阴性的判断，广泛用于各种特异RNA或DNA的检测。
[0003]为了提高荧光强度，微滴数字PCR通过产生大量的(20万个左右)由油包着样本的微小微滴，对这些微滴进行PCR加温降温循环，来提高微滴中探针数量。然后再用激光照射这些经过PCR处理的微滴。如果某些微滴是阳性，这些微滴就会发出荧光，并通过荧光照相机来照像，所得的图像的像素的强度与荧光的强度成正比。
[0004]其中荧光的强弱是由微滴的阳性程度决定的，而图像的背景(阴性微滴的强度)由环境的噪音或泄露的激发光的光强决定。如果阳性信号的强度不够强或背景的噪音(阴性)强度太高，就很难把阳性微滴从阴性微滴中区分开来，从而造成难以正确区分弱阳性微滴，造成假阳性/假阴性的错误判断，影响检测的准确性。

技术实现思路

[0005]为了提高检测的精度和准确性，本专利技术第一个方面提供了一种用于核酸检测、分析的系统，包括：
[0006]微滴发生器，用于得到包括样品和M个荧光探针的微滴，M大于等于1；
[0007]PCR处理器，用于扩增微滴中的核酸；
[0008]流式细胞仪，用于检测和分析扩增后的微滴；
[0009]把PCR处理后的装满微滴的芯片的出口端和流式仪的进样口直接连接起来以提高实验的灵敏度，准确性，效率和速度。
[0010]本专利技术微滴是通过本领域常规的微滴发生器产生的油性微滴，微滴中包括样品和荧光探针，并通过PCR进行扩增后进行荧光检测，专利技术人发现，相比于如图1所示，荧光照相计数阳性微滴，计算阳性微滴时，由于信噪比有限，从而影响阳性率统计的问题，本专利技术使用流式细胞仪，可进一步减少背景噪声，提高信噪比，从而提高阳性检测的灵敏度，准确性。
[0011]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述流式细胞仪包括：L个激光器和N(i)，(i＝1
…
,L，)个荧光接收通道，每个激光器对应N(i)(i＝1,
…
,L)个荧光接收通道，N(i)(i＝1，
…
,L)大于等于1，优选为4～32；
[0012]所述激光器用于发射激光激发荧光探针，所述荧光接收通道用于接收荧光探针激发后的发射光谱，得到荧光探针在该荧光接收通道中的信号。
[0013]此外，相比于荧光照相时，接收一定波段的激光，计算一定波段的总荧光信号强度，通过使用流式细胞仪，可使用包括多个不同波段的接收通道进行接收，且也可使用不同的激光器进行激发，从而得到较高的信噪比的荧光信号，更显著地区分阳性微滴和阴性微
滴，。
[0014]作为本专利技术一种优选的技术方案，不同荧光接收通道的波段不同，N(i)，(i＝1,
…
,L)个荧光接收通道的波段为400
‑
800nm。本专利技术不对每个通道的波段进行控制，可为连续式或间断式的，根据不同的流式细胞仪进行选择，其中其总的波长范围可在400～800nm之间，其中通过选择不同波段的荧光接收通道，来适应不同的荧光探针，可有效提高对荧光数据的选择，有利于对微滴阴性和阳性的判断。
[0015]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述流式细胞仪为传统流式细胞仪或光谱流式细胞仪。本专利技术不对流式细胞仪的种类做具体限定，其中不同流式细胞仪的信噪比均较荧光照相高。
[0016]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述传统流式细胞仪中，每个荧光探针的信号由1个荧光接收通道得到，所述光谱流式细胞仪中，每个荧光探针的信号由N(i),(i＝1,
…
,L)个荧光接收通道得到。
[0017]其中传统和光谱流式细胞仪的不同之处主要在光学系统的不同，其中核酸的检测主要通过和核酸反应的荧光探针进行检测，不同荧光探针具有不同的发射光谱和吸收光谱，一般是通过吸收光谱确定合适的激光器发射合适波长的光，激发荧光探针，并通过通道接收荧光探针的发射光谱，因为不同荧光探针在不同波段的发射光谱的强度不同，故需要选择对应波段的通道进行接收，而传统流式细胞仪即时选择和发射光谱强度最高范围的波段的通道进行该荧光探针的检测，得到不同探针的阳性微滴的个数从而得到样本的阳性率。而全光谱流式细胞仪是通过得到一个或多个通道中该荧光探针的信号，并通过PMF模型和UNMIX模型等源解析模型得到不同探针的阳性微滴数，计算阳性率。
[0018]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述扩增后的微滴中核酸浓度为(0.5～8)*106个/mL，优选为(4～8)*106个/mL。为了提高阳性和阴性微滴的区别，提高阳性率检测的准确性，一方面可通过扩增提高核酸浓度和探针浓度，另一方面需要提高微滴的尺寸，目前传统微滴的尺寸在80微米左右，当微滴尺寸太小，会造成阳性微滴的强度过小，甚至造成无法检出阳性微滴，而专利技术人发现，通过本专利技术提供的PCR和流式细胞仪的集成，由于流式仪较高的信噪比，可用于更小微滴的阳性检测，从而当对于体积一定的微滴生成芯片来说，可得到成倍增加的微滴数量，从而促进样本阳性率的测试的准确性。
[0019]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述微滴的直径小于等于80微米，优选为小于等于60微米，更优选为小于等于40微米，更优选为小于等于20微米。
[0020]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述流式细胞仪的通道的直径和微滴直径差为0～100微米，优选为10～80微米，更优选为40～80微米。
[0021]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述流式细胞仪的进样方法选自常压进样、负压进样或正压进样。作为本专利技术一种优选的技术方案，所述正压进样或负压进样中压力为20～1000mm水柱。
[0022]此外，专利技术人发现，相比于较大尺寸的微滴，常规的进样口和进样方法难以满足本专利技术微滴的检测速度需要。而专利技术人发现，通过将PCR和流式细胞仪集成并控制通道的尺寸，可促进检测时激光发射和荧光接受的有效性，可靠性，提高检测速度，促进阳性检测灵敏度，精确性的提高，减少气泡。
[0023]本专利技术与现有技术相比具有以下有益效果：
[0024]1、当用于核酸检测时，一般将带有样品的油滴经过PCR扩增后，拍摄荧光图像计数阳性微滴，得到样本的阳性率，但是对于弱阳性微滴，难以进行判断，这一方面是因为在荧光反射成像时噪声的影响，而本专利技术通过PCR和流式细胞仪集成，利用流式细胞仪更高的信噪比，促进对弱阳性微滴的分辨，提高检测灵敏度。
[0025]2、因为信噪比低的原因，传统的微滴数字PCR的微滴直径在80微米左右，微滴体积过小会导致阳性微滴的强度太小，而使得把阳性微滴区分出来非常困难。因为流式仪的SNR很高，使得流式仪能区分出体积较小的阳性微滴，比如20微米的微滴。对一个容积为20微升的微滴生成芯片来说，它本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸检测、分析的系统，其特征在于，包括：微滴发生器，用于得到包括样品和M个荧光探针的微滴，M大于等于1；PCR处理器，用于扩增微滴中的核酸；流式细胞仪，用于检测和分析扩增后的微滴；把PCR处理后的装满微滴的芯片的出口端和流式仪的进样口直接连接起来以提高实验的灵敏度，准确性，效率和速度。2.根据权利要求1所述的用于核酸检测、分析的系统，其特征在于，所述流式细胞仪包括：L个激光器和荧光接收通道，每个激光器对应N(i)(i＝1,
…
,L)个荧光接收通道，L大于等于1，N(i)(i＝1,
…
,L)大于等于1；所述激光器用于发射激光激发荧光探针，所述荧光接收通道用于接收荧光探针激发后的发射光谱，得到荧光探针在该荧光接收通道中的信号。3.根据权利要求2所述的用于核酸检测、分析的系统，其特征在于，L个不同荧光接收通道的波段不同，N(i),(i＝1,
…
,L)个荧光接收通道的波段为400
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800nm。4.根据权利要求3所述的用于核酸检测、分析的系统，其特征在于，所述流式细胞仪...

【专利技术属性】
技术研发人员：于源华，祁文康，宫平，
申请(专利权)人：长春技特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：