本发明专利技术涉及用于显微术中的三维成像的方法，其中借助于校正元件在检测光路中校正来自样本的检测辐射的像差；以空间分辨的形式捕获校正的检测辐射。该方法的特征在于，确定校正元件的最佳可能校正设置，通过最佳可能校正设置，在最佳可能校正设置时出现的像差得以尽量减少；并且基于最佳可能校正设置，确定缺陷校正设置，在缺陷校正设置下出现的像差导致检测辐射的不对称点扩散函数。确定在缺陷校正设置下出现的不对称PSF，并且引发所确定的缺陷校正设置。二维地获取样本的图像数据，并且基于不对称PSF的不对称性的相应被捕获的显现，在不同情况下将检测光路的光轴方向上的位置至少分配给选定的图像数据。本发明专利技术还涉及用于显微术的装置和显微镜。微术的装置和显微镜。微术的装置和显微镜。
【技术实现步骤摘要】
显微术中进行三维成像的方法、装置和显微镜
[0001]本专利技术涉及使用不对称点扩散函数(PSF)在显微术中进行三维成像的方法。本专利技术还涉及用于实施该方法的装置和显微镜。
技术介绍
[0002]在显微
，特别是当使用生物样本的标记结构和分子(物体)成像时，需要高图像分辨率，同时需要对样本和待成像的物体具有低水平的应力。如果图像数据的捕获(图像记录)发生在很长的照明时段内和/或发生多次，最小化样本上的应力是特别有利的。例如，当要检测和捕获(追踪)一个或多个物体在特定时段内的位置变化时，使用这种照明方案。
[0003]从现有技术中已知，用光片来照明样本在本质上仅激发了薄的照明平面中的标记物体，用于发射检测辐射(参见例如DE 10 2016 212 020 A1)。借助于照明辐射而激发的该物体在照明平面内的位置可以借助于空间分辨(二维)检测器(相机)来确定，并且以这种方式可以二维地定位各个检测辐射的来源。
[0004]为了获得关于检测光路的光轴方向(Zc方向；3D)上的原点位置的二维(2D)定位信息，可以以这样的方式修改点扩散函数，即：使得点光源的成像的旋转位置和/或轮廓形状可以用于推断点光源的Zc位置。
[0005]例如，可以从检测物镜的焦点位置偏移地辐射光片，并且分析点光源的成像的轮廓形状，以便确定所捕获的点光源的Zc位置(DE 10 2013 208 926 A1)。
[0006]也有可能借助于相应设计的掩模(双螺旋法)将PSF形成为双螺旋，使得点光源被成像为两个独立的光点。这些点相对于彼此的相对旋转位置允许确定相关的Zc位置(WO 2021/039636 A2；帕瓦尼(Pavani)等，2009：“利用双螺旋点扩散函数的超越衍射极限的三维单分子荧光成像(Three
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dimensional，single
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molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double
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helix point spread function)”；PNAS 106：29954
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2999)。
[0007]根据现有技术的解决方案的缺点是生成双螺旋PSF所需的昂贵的掩模，以及根据DE 102013208926A1的解决方案可应用的光学装置的非常有限的范围，其中，特别地，检测光路的光轴倾斜地穿过具有不同折射能力的单独的层，例如使用倒置显微镜时就是这种情况。
技术实现思路
[0008]本专利技术基于提出一种方法的目的，利用该方法减少了现有技术的缺点，并且使得具有高分辨率的三维成像成为可能。本专利技术的目的还在于提出一种合适的装置，特别是光学装置和具有这种装置的显微镜，可以借助于该装置执行该方法。
[0009]该目的通过独立和备选独立权利要求的主题来实现。从属权利要求的主题是有利的发展。
[0010]当执行根据本专利技术的用于显微术中三维成像的方法时，借助于至少一个校正元件在检测光路中校正来自样本的检测辐射的像差。在这种情况下，样本特别设置有标记分子(也就是：探针、标记)，例如荧光染料(荧光团)，从而可以特别捕获例如样本的特定结构和/或分子的图像数据。在这种情况下，检测辐射可以是在特定波长范围内被完全反射或反射的照明辐射。检测辐射也可以是由荧光染料发射的荧光辐射，其已经被相应的照明辐射的效应激发。借助于校正元件校正的检测辐射以空间分辨的形式被合适的空间分辨二维检测器捕获。在这种情况下，检测器的检测平面优选地相对于检测光路的光轴基本正交地对准。
[0011]根据本专利技术，该方法的特征在于，确定校正元件的最佳可能校正设置，通过该最佳可能校正设置，在该最佳可能校正设置下出现的像差得以尽量减少。在这种情况下，最佳可能校正设置是根据技术和光学条件优化的校正元件的设置，特别是关于技术元件和检测光路的尺寸优化。为了确定最佳可能校正设置，可以通过一系列测试和/或模拟来确定点扩散函数(下文中也称为检测PSF)，并且特别是在实际执行该方法之前以可检索的方式存储该点扩散函数。
[0012]至少一个校正元件的存在对于本专利技术是必不可少的。这通常布置在检测光路中。替代地或附加地，在照明光路中可以有校正元件。重要的是，它对检测PSF的形成的影响是由本专利技术提供的。为了简单起见，下文中主要参考校正元件。
[0013]基于该最佳可能校正设置，确定缺陷校正设置，在该缺陷校正设置下出现的像差、特别是持续像差(persisting aberration)导致检测辐射的不对称点扩散函数。在这种情况下，缺陷校正设置应该允许定性地充分捕获图像数据，并且同时提供关于点光源在光轴方向上的位置的信息。在缺陷校正设置下出现的不对称检测PSF是借助于模拟以经验方式或计算方式确定的，并且被提供用于捕获的图像数据的进一步处理。经验确定和计算确定可以彼此结合。
[0014]对何时实现合适的缺陷校正设置的评估可以例如基于从现有技术中已知的Fisher信息来进行(在这方面也参见前面提到的：Pavani等人，2009)。
[0015]实际上不必设置该最佳可能校正设置。理论上已知就足够了。如果在反馈控制过程中顺序地确定了最佳可能校正设置，则与此相当的是对最佳可能校正设置的明显近似(obvious approximation)。例如，如果图像捕获的像差低于预定的极限值，则获得明显近似。
[0016]如此确定的缺陷校正设置例如是通过校正元件被致动和被相应地设置而引发的。在提供缺陷校正设置之后，二维地捕获样本的图像数据。基于检测PSF的不对称性的相应被捕获的显现(manifestation)，在各个情况下将在检测光路的光轴方向上的位置、特别是坐标形式的位置(从这里开始也称为：Zc位置)至少分配给选定的图像数据，并且优选地进行存储。所捕获的图像数据允许所捕获的图像数据的三维表示。
[0017]本专利技术的本质是使用校正元件(用于校正出现的像差)，以便在校正元件的帮助下产生不对称检测PSF。与最初为检测辐射的现有像差的最大可能校正的校正元件设想的功能相反，有意将其转换成缺陷校正设置。然而，令人惊讶地，非优化校正产生的缺点允许获得关于所捕获的图像数据的Zc位置的信息。
[0018]在本专利技术的描述过程中使用的一些术语将在下面更详细地解释。
[0019]由于其构造以及光学元件布置在其中时的性质和设置，检测光路在检测辐射沿着
检测光路传播期间导致检测辐射的特定行为。这种修改的传播行为在此由检测PSF表示。
[0020]待成像的样本的照明可以通过以扫描方式在样本上移动的至少一个照明点或线性照明来进行，其中后者同样可以以扫描方式移动。也可以发生面照明(areal illumination)。面照明的一个实施例可以是例如光片，或者以宽场照明的形式进行面照明。
[0021]在本说明书的其余部分中，通过示例的方式参考了借助于光片的照明(见下文)。如果使用这种光片，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于显微术中的三维成像的方法，其中，借助于校正元件(2KE、3KE)在检测光路中校正来自样本(5)的检测辐射(DS)的像差；并且以空间分辨的形式捕获校正的检测辐射(DS)；其中，确定所述校正元件(2KE、3KE)的最佳可能校正设置，其中，通过所述最佳可能校正设置，在所述最佳可能校正设置时出现的像差得以尽量减少；基于所述最佳可能校正设置，确定缺陷校正设置，其中在所述缺陷校正设置下出现的像差导致所述检测辐射(DS)的不对称点扩散函数(PSFasymm)；确定在所述缺陷校正设置下出现的所述不对称PSF(PSFasymm)；引发确定的所述缺陷校正设置；二维地捕获所述样本(5)的图像数据；以及基于所述不对称PSF(PSFasymm)的不对称性的相应被捕获的显现，在各个情况下将所述检测光路的光轴(A2)的方向上的位置(Zc位置)至少分配给选定的图像数据。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，不对称PSF(PSFasymm)的形成是借助于作为光片(6)的照明辐射(BS)的适应性设计来实现的，其中沿着照明光路的光轴(A1)将所述照明辐射(BS)引导到样本空间中并且引导到布置在所述样本空间中的样本(5)上，并且相对于所述检测光路的焦平面不对称地设置所述光片(6)的位置，和/或相对于所述照明光路的光轴(A1)的方向、正交地调制所述光片(6)的显现。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过将所述光片(6)和所述样本(5)移动到相对于彼此的不同定位中来扫描所述样本(5)的体积，并且根据相对定位、在各个情况下捕获至少一个图像，其中，根据所述相对定位，所述样本(5)被所述光片(6)照明的区域以所述光片(6)的厚度(D)的一部分彼此重叠。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，捕获所述样本(5)中的至少一个物体(9、9.1、9.2)在照明时段内的位置变化，其中，对体积的扫描以下述任一方式发生：i)如果待捕获多个物体(9、9.1、9.2)的位置变化，则在每个定位处照明一次；或者ii)如果捕获和定位的是单个物体(9、9.1、9.2)，则根据捕获的位置变化来控制并校正所述光片(6)的定位。5.一种具有检测光路的用于显微术的装置，包括：检测物镜(3)，用于捕获检测辐射(DS)；空间分辨检测器(19)，用于所述检测辐射(DS)的图像点的二维捕获；以及校正元...
【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：卡尔蔡司显微镜有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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