本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了兔抗人整合酶相互作用分子1(INI1)兔单克隆抗体OTIR4G9，抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。发明专利技术人还提供抗INI1兔单克隆抗体的制备方法，所述的抗体利用INI1多肽免疫新西兰大白兔后筛选特异性B细胞经分子克隆重组产生。所发明专利技术的抗INI1兔单克隆抗体可用于检测INI1蛋白的免疫检测工具中，包含免疫组织化学检测试剂盒与其他标记组织细胞试剂盒、试纸等。本发明专利技术所述单克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度可与INI1蛋白进行特异性结合，显著提高了INI1蛋白免疫检测的特异性和可靠性。了INI1蛋白免疫检测的特异性和可靠性。
【技术实现步骤摘要】
抗人整合酶相互作用分子1(INI1)兔单克隆抗体的制备及其用途
[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及抗整合酶相互作用分子1(INI1)兔单克隆抗体与整合酶相互作用分子1特异性结合，用于免疫检测的方法和应用。
技术介绍
[0002]INI
‑
1基因位于22q11.2，又名hSNF 5，SMARCB1及BAF47，是SWI/S NF复合物的核心亚基，在ATP依赖性染色质的重塑中起作用，从而调控基因表达，并与多种细胞功能相关，包括修复受损DNA和调控细胞生长。在1998年，采用基因定位方法，在恶性横纹肌样瘤中首次明确了由于INI1双侧等位基因失活导致的INI1蛋白缺失表达是MRT特征性改变。SMARCA4(BRG1)、S MARCA2(BRM)与SMARCB1(INI1)同属于染色质重塑复合体家族成员，这些基因突变或缺失导致基因失活，免疫组织化学检测体现在对应蛋白表达丢失。这些蛋白表达缺失在不同肿瘤中可单独或几个伴随出现。常见于侵袭性强、预后差的高度恶性肿瘤，组织学上肿瘤细胞常有横纹肌样细胞特征。INI1表达缺失最常见于恶性横纹肌样瘤、上皮样肉瘤。其次，部分上皮样恶性外周神经鞘膜瘤、恶性色素性神经鞘肿瘤、上皮样神经鞘瘤、低分化脊索瘤及少数骨外黏液样软骨肉瘤和软组织肌上皮肿瘤均可见INI1表达缺失。
[0003]现在的研究表明INI1在不同肿瘤的表达模式有所不同。INI1蛋白异常表达可分为三种模式：完全丢失，镶嵌表达和表达降低。完全丢失时INI1蛋白在肿瘤细胞的表达为阴性，作为内对照的间质细胞和血管内皮细胞等细胞阳性。目前INI1单抗在病理诊断上常用于恶性横纹肌样瘤及相关疾病的诊断。
[0004]免疫组化病理建立在蛋白质水平上，可以进一步判断肿瘤的组织来源、原发部位、病理分型、残留边缘癌细胞等，除了诊断作用以外还具有指导预后的作用；究其核心免疫组化病理需要有特异性强，灵敏度高的抗体，尤其是单克隆抗体。随着对疾病和INI1蛋白研究的深入，抗INI1的单克隆抗体的应用范围不断的扩展延伸。同时伴随着自动化仪器的普及，各大检测平台检测条件的差异，以及病理AI的快速发展，对抗体质量要求越来越高。但是现在缺乏优质的抗INI1的单克隆抗体，开发特异性强，灵敏度高适用于不同检测平台的抗INI1单克隆抗体迫在眉睫。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于提供一种与INI1蛋白特异性结合的兔单克隆抗体，及其在制备用于检测INI1蛋白的免疫检测工具中的应用。
[0006]本专利技术提供抗INI1的兔单克隆抗体为OTIR4G9，该兔单抗的抗体轻链可变区(VL)含有108个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.4所示；重链可变区(VH)含116个氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0007]所述兔单克隆抗体特异性的识别INI1蛋白。
[0008]专利技术人提供所述抗体的制备方法，合成3段多肽并分别偶联至载体蛋白KLH上作为
免疫原，用于新西兰大白兔的免疫。获取免疫动物的外周血单核细胞(PBMCs)后分选特异性B细胞，再经分子克隆、转染重组载体至哺乳动物细胞中，培养细胞获得含分泌抗体的上清，将上清经亲和层次纯化获得抗INI1的兔单克隆抗体。
[0009]本专利技术还提供抗INI1兔单克隆抗体在制备用于检测INI1蛋白的免疫检测工具中的应用。所述免疫检测工具为包括试剂盒、芯片或试纸等。
[0010]本专利技术还提供一种免疫组织化学检测试剂盒，包括抗INI1兔单克隆抗体，可检测组织细胞中INI1蛋白的表达状况。所述组织包含但不限于正常组织：扁桃体、甲状腺、脾脏和胃；肿瘤组织：肺癌、乳腺癌、甲状腺肿瘤、淋巴瘤和INI1缺失表达的肿瘤组织。
附图说明
[0011]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0012]图1抗INI1兔单克隆抗体OTIR4G9在正常组织上的IHC结果。
[0013]图2抗INI1兔单克隆抗体OTIR4G9在INI1阳性肿瘤组织上的IHC结果。
[0014]图3抗INI1兔单克隆抗体OTIR4G9在INI1缺失表达肿瘤组织上的IHC结果。
具体实施方式
[0015]本专利技术公开了抗INI1兔单克隆抗体在制备方法和用于免疫检测的方法及应用。下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，相关人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0016]实施例1：抗INI1兔单克隆抗体的制备
[0017]1.抗原的制备
[0018]在NCBI网站上获取INI1蛋白序列NP_003064.2，含有385个氨基酸以此作为标准序列。选取第114
‑
131、246
‑
262、357
‑
379位氨基酸序列做合成并分别偶联至载体蛋白KLH上作为免疫原。
[0019]2.动物免疫
[0020]上述合成的INI1多肽，将其按照1：1：1的比例混合后以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下注射方法免疫2kg左右的新西兰大白兔，免疫剂量为500μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为250μg/只。免疫三次后取尾血以ELISA和IHC法梯度稀释测定血清效价；依据ELISA效价128000时的OD450大于1.0和IHC检测在组织上的核染信号强度为标准，根据结果判定是收集PBMCs或是继续免疫。
[0021]3.PBMCs分离、特异性B细胞分选以及克隆重组
[0022]将免疫后血清检测效价达到标准的新西兰大白兔仰卧固定在手术台上，剃除心脏部位的被毛，酒精棉球擦拭消毒皮肤，选择心搏最明显处用50ml注射器穿刺，针头刺入心脏后即有血液涌入注射器，取得所需血量后迅速将针头拔出，将注射器中的全血转入无菌50ml管中，与等量的PBS混匀后逐滴缓慢的加入到淋巴细胞分离液上方，室温400
×
g离心30min，离心后，液面由上至下分为四层：黄色血浆层、白色薄膜层(即单核细胞层)、分离液
层及红细胞层。小心吸取单核细胞层并用PBS洗涤去除血小板和淋巴细胞分离液后即可获得兔PBMCs。从中继续分选抗原特异性的B细胞并进行培养，以抗原包被的ELISA板筛阳性克隆。裂解阳性克隆并收集裂解液，从中提取RNA后将其反转录为cDNA，天然配对的兔单克隆抗体轻重链全长序列从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，通过克隆重组方法构建兔单克隆抗体表达载体，并经测序确定序列。
[0023]4.单克隆抗体的制备和纯化
[0024]为了获得特异性识别人INI1蛋白的兔单克隆抗体，本专利技术将兔单克隆抗体重链、轻链基因装载到表达载体上，将重组本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种抗INI1兔单克隆抗体，其特征在于：所述兔单克隆抗体为OTIR4G9。2.一种抗INI1兔单克隆抗体的制备方法，特征在于：选取INI1蛋白的第114
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131、246
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262、357
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379位氨基酸序列分别偶联至载体蛋白KLH上作为免疫原，序列如SEQ ID NO.1
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SEQ ID NO.3所示。将上述3中多肽混合后通过注射免疫新西兰大白兔，获取免疫动物的外周血单核细胞(PBMCs)，分选特异性B细胞，经分子克隆、重组载体转染至哺乳动物细胞中，将上清经亲和层次纯化获得。3.一种抗INI1兔单克隆抗体，其特征在于：所述抗体轻链可变区(VL)含有108个氨基酸，含有3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域分别为27
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34aa、52
‑
...
【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书四页序列表二页附图二页，
申请(专利权)人：无锡傲锐东源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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