褐飞虱NlNPF基因及其dsRNA在防治褐飞虱的应用制造技术

本发明专利技术公开了褐飞虱NlNPF基因及其dsRNA在防治褐飞虱的应用。NlNPF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ORF序列如SEQ ID NO.1第55

【技术实现步骤摘要】
褐飞虱NlNPF基因及其dsRNA在防治褐飞虱的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及褐飞虱NlNPF基因及其dsRNA和针对该基因的RNA干扰在控制褐飞虱方面的应用。

技术介绍

[0002]褐飞虱[Nilaparvata lugens]属于半翅目飞虱科(Hemiptera:Delphacidae)，是一种可以远距离迁飞危害的水稻害虫，对环境有极强的适应性，是目前危害我国和许多东南亚国家水稻的首要害虫(Sogawa,1982；Velusamy et al.,1986)。褐飞虱对寄主植物选择单一，只在水稻或野生稻上取食和产卵(Dyck et al.,1979；洪晓月等，2007；Wang et al.,2008)。褐飞虱主要通过刺吸寄主水稻韧皮部汁液给水稻生长发育造成严重影响，褐飞虱取食时形成的唾液鞘会阻塞维管束，而褐飞虱在取食后又分泌大量的“蜜露”，“蜜露”中含有大量的氨基酸和糖，可以使寄主水稻感染细菌(李春凤等，2019)，受褐飞虱危害严重的水稻会引起瘫痪倒伏，引起水稻“虱烧”现象，导致大田水稻严重减产甚至绝收。同时褐飞虱除了自身需求对水稻植株造成影响外，也作为媒介传播水稻病毒病如草状丛矮病和齿叶矮缩病，水稻病毒病会给水稻产量带来灾难性后果(Hibino,1996；程遐年等，2003)。20世纪80年代开始，我国的褐飞虱发生面积约1330
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2000万hm2，约为我国种植水稻面积的二分之一，给我国水稻生产造成严重损失(李汝铎等，1996)，在近三十年来看，褐飞虱危害我国水稻的主要特征有三个：爆发频率增加、危害范围扩大、危害程度加大(王鹏等，2013)。
[0003]RNAi技术即RNA干扰技术，RNAi主要指的是由双链RNA(dsRNA)诱导的对靶标基因mRNA进行沉默的技术，进而影响靶标生物的正常生理活动的现象。RNAi的研究开始于1995年，康奈尔大学Guo等在实验中对线虫Caenorhabditis elegans进行正义RNA和反义RNA干扰后，发现正义RNA或反义RNA都会引起线虫Caenorhabditis elegans的Parl基因表达下调(Guo et al.,1995)。1998年，为了揭示该现象的出现，华盛顿卡耐基研究院Fire等将纯化后的单链RNA注入线虫Caenorhabditis elegans，发现只有微弱的抑制效果，而将纯化后的dsRNA注入线虫Caenorhabditis elegans中，发现纯化后的dsRNA能对相关基因的表达有较强的抑制效果，由此证实Guo和Kemphues的实验中正义RNA抑制Parl基因表达是因为有微量的dsRNA污染，导致实验结果与理论不符，成为最早的RNAi现象(Fire et al.,1998)。到目前为止，由于RNAi技术操作简便、成本相对较低，更重要的是RNAi技术的特异性以及高效性的特点，已经广泛应用到了有关昆虫研究的各个领域(Bell
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s,2010)，如昆虫基因功能的验证、害虫防控防治、农药开发新靶标等(田宏刚等，2012；王会冬等，2012)。
[0004]目前利用RNAi手段对昆虫进行干扰试验的技术已经比较成熟，在与昆虫有关的研究之中利用RNAi技术的领域主要集中在基因功能、RNAi诱导转基因抗虫植物以及益虫疾病控制等方面(Baum et al.,2007；Tian et al.,2009；Chen et al.,2010；Hunter et al.,2010；Yao et al.,2010)，其主要的导入昆虫体内的手段有三种，即饲喂、注射以及组织培养，需针对不同实验需求选择最佳的导入方式。例如沉默豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)唾
液蛋白C002的实验是第一个对刺吸式昆虫唾液蛋白功能研究的实验，通过实验发现豌豆蚜的取食和C002唾液蛋白有很重要的关系(Mutti et al.,2006)。纪锐(2013)通过RNA干扰技术沉默唾液蛋白Nl1860后，发现蜜露量显著减少，死亡率显著增加等。但另一方面，利用RNA干扰研究唾液蛋白也有一定的局限性，例如有些昆虫某些基因只有在昆虫特定龄期、特定时期或者特定组织中出现；如烟草天蛾(Manduca sextai)和家蚕(Bombyx mori)除了血淋巴以外的其他生物组织难以被基因沉默(Eleftherianos et al.,2007；Miller et al.,2008；黄晓慧，2016)；而另一方面有些唾液蛋白基因是昆虫正常发育不可缺少的部分，如果对这些基因进行RNA干扰会使昆虫迅速死亡，难以对后续该基因在昆虫取食中的作用进行实验。
[0005]dsRNA在实际应用中由于在害虫体内快速降解和低效吸收等问题导致不能发挥全部作用(Garbutt et al.,2013；Luo et al.,2013；Ren et al.,2014；Wynant et al.,2014)。因此，提高dsRNA的稳定性和细胞吸收能力是实现RNAi技术的关键。目前，纳米粒子(nanoparticle,NP)介导的RNAi防治技术逐渐成为害虫防治中的热点。早在2009年就有研究人员发现dsRNA在被脂质(liposomes)包裹的情况下通过喂食就可以在果蝇体内产生高效的RNAi效应。不仅如此，这类现象在其他物种中也得到了验证。在亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis中，一种阳离子荧光纳米粒子(FNP)介导的喂食RNAi可以有效地沉默亚种玉米螟关键发育基因的表达，产生高致死率(He et al.,2013)。在大豆蚜Aphis glycines中，研究人员利用聚合物包裹的dsRNA突破了害虫体壁屏障。在冈比亚按蚊Anopheles gambiae中，壳聚糖(chitosan)能够显著提高试虫对于喂食dsRNA的敏感性(Zhang et al.,2010)。上述例子说明，纳米粒子搭载的dsRNA应用前景广阔。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种从褐飞虱中克隆的NlNPF基因的cDNA序列以及蛋白质序列。通过显微注射法和助剂介导的RNAi沉默褐飞虱NlNPF基因，降低褐飞虱对水稻的取食，从而保护水稻。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种褐飞虱NlNPF基因，其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ORF序列如SEQ ID NO.1第55
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354位碱基所示。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供褐飞虱NlNPF基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供一种褐飞虱NlNPF基因的dsRNA，是由SEQ ID NO.1所示序列的能达到抑制NlNPF基因表达效果的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RN A。
[0010]优选地，所述dsRNA的PCR扩增引物组为：dsNlNPF
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种褐飞虱NlNPF基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1第55
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345位碱基所示。2.一种由权利要求1所述的褐飞虱NlNPF基因编码的蛋白质，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种褐飞虱NlNPF基因的dsRNA，其特征在于，由SEQ ID NO.1所示序列的能达到抑制NlNPF基因表达效果的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RNA。4.根据权利要求3所述的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA的PCR扩增引物组为：dsNlNPF
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F：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGCATCAAATCCGAGACAATTC和dsNlNPF
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R：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCTGAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张振飞，袁龙宇，梁其昌，李燕芳，肖汉祥，
申请(专利权)人：广东省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：