核酸适配体功能化超小发光金纳米颗粒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了核酸适配体功能化超小发光金纳米颗粒及其制备方法与应用。该方法为：将氯金酸水溶液与谷胱甘肽配体水溶液在室温下搅拌反应，反应颜色变为无色时，加入硫酰化的核酸适配体反应，然后加入硼氢化钠水溶液，反应，溶液颜色变为棕色，停止反应，超滤，最后利用含有氯化镁和氯化钠的乙醇溶液去沉淀核酸适配体功能化的金纳米颗粒，去除上清液中的游离的硫酰化核酸适配体，加入缓冲液和水重新溶解沉淀，超滤浓缩后4℃条件下保存，得到核酸适配体功能化金纳米颗粒材料。本发明专利技术产品生物相容性好，毒性低，荧光背景干扰低，检测灵敏度高和选择性好，用于研究细胞和肿瘤成像操作简单，可以实现活体肿瘤无创、高分辨和低信背比早期诊断。早期诊断。早期诊断。

【技术实现步骤摘要】
核酸适配体功能化超小发光金纳米颗粒及其制备方法与应用


[0001]本专利技术公开了一种核酸适配体功能化近红外二区发光金纳米材料的制备方法及其在肿瘤模型的高选择性和高灵敏诊断方面的应用。

技术介绍

[0002]目前，恶性肿瘤的发病率呈现逐年上升，且死亡率居高不下，严重威胁人类健康和生命。高灵敏度和高选择性的肿瘤诊断技术具有积极的临床意义，可帮助医生尽早提出治疗方案、对治疗效果进行评估、监控肿瘤的复发和转移及预后评估等。因此，急需开发高灵敏度和高选择性的纳米材料用于癌症诊断技术来满足临床需求。
[0003]核酸适配体又称为化学抗体，是一段特殊的寡核苷酸序列，具有尺寸小、成本低、免疫原性低、易合成和修饰的特点，能与各种靶标高特异性和高亲和力结合。越来越多的核酸适配体功能化纳米材料，将其作为纳米探针用于荧光成像技术，来增加了纳米材料识别、信号放大和细胞摄入等功能，拓宽了其在生物传感、生物成像和靶向药物递送等应用。然而这些纳米探针面临一些挑战，目前生物成像的造影剂包括传统小分子探针和常规纳米探针。传统小分子探针尺寸小，具有可肾清除的优势，但是存在靶向效率低的局限；常规纳米探针尺寸大，具有靶向效率高的优点，但是难以排出体外，因此需要开发高效靶向和可肾清除的新型探针对疾病进行高灵敏和高选择性生物成像。发光金属纳米成像探针是处于金属原子和金属纳米颗粒之间的一类探针，发光金属纳米成像探针具有光学性质独特、表面化学性质可调和可肾清除的特点。它兼具了靶向效率高和可肾清除的优点。因此，将核酸适配体修饰在超小发光金纳米颗粒上，将有更广泛的临床应用前景。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术提供了核酸适体功能化超小金纳米颗粒的制备及其在体外对肿瘤细胞的诊断和体内肿瘤的诊断的应用方法。本专利技术提供的核酸适配体功能化金纳米颗粒，可以特异性结合癌细胞上过度表达的蛋白质受体。从而提高肿瘤靶向效率。因此，该核酸适配体功能化超小发光金纳米颗粒，可用于体外肿瘤细胞的高灵敏和高选择性诊断，由于其近红外区发光、可肾脏清除、靶向效率高和选择性好等优点，因此它也可用于体内肿瘤组织的高灵敏和高选择性诊断。并可通过激光共聚焦和近红外区荧光成像相机可观察材料在体外肿瘤细胞和体内肿瘤组织部分的荧光变化的研究。
[0005]本专利技术可通过如下技术方案来实现。
[0006]一种核酸适配体功能化金纳米颗粒材料的制备方法，包括以下过程：
[0007]将氯金酸水溶液与谷胱甘肽配体水溶液在室温下搅拌反应半小时，反应颜色由黄色变为无色时，加入硫酰化的核酸适配体反应10分钟，然后加入硼氢化钠水溶液，搅拌反应24h，溶液颜色变为棕色，停止反应，然后，超滤去除未反应的底物和多余的谷胱甘肽，最后利用含有氯化镁和氯化钠的乙醇溶液去沉淀核酸适配体功能化的金纳米颗粒，去除上清液中的游离的硫酰化核酸适配体，加入缓冲液和水重新溶解沉淀，超滤浓缩后4℃条件下保
存，得到核酸适配体功能化金纳米颗粒材料。
[0008]进一步的：所述硫酰化核酸适配体为硫酰化AS1411，硫代化AS1411由两个区域组成：硫代磷酸酯骨架区域可以作为前体结合区，磷酸酯骨架区域作为分子识别区，核酸适配体不仅限于ASl411。
[0009]进一步的：所述还原剂为：硼氢化钠，还原剂不仅限于硼氢化钠。
[0010]进一步的：所述氯金酸、巯基配体混合得到的反应溶液中，初始氯金酸与谷胱甘肽的物质的量的比值为1∶0.5至1∶1；而硫酰化核酸适配体与谷胱甘肽的物质的量比值为1∶30至1∶5；再加入硼氢化钠时，初始氯金酸与硼氢化钠的物质的量的比值为1∶8至1∶20。
[0011]进一步的：反应液pH为8～12，反应温度为4
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40℃，反应时间为6
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40h，所述核酸适配体功能化金纳米颗粒材料为单分散纳米颗粒，单颗金纳米颗粒粒径为1.0
‑
3.0nm。
[0012]进一步的：所述超滤和浓缩使用的超滤管的膜孔径为3
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50kDa，超滤与浓缩离心温度为4
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25℃，离心转数为2000
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5000rpm，离心时间为10
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30min。所述沉淀法所用的乙醇浓度为35％
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60％，氯化钠浓度为100
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1000mM，氯化镁的浓度为10
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50mM。
[0013]进一步的：所述合成产物可以是单价核酸适配体功能化金纳米颗粒，也可以是多价核酸适配体功能化金纳米颗粒。
[0014]由以上所述制备方法得到核酸适配体功能化金纳米颗粒材料用于检测肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：将细胞以2000个每皿的密度种于35mm的成像皿中，在培养箱中培养24h，待其贴壁后，加入核酸适配体功能化金纳米颗粒材料于细胞，37℃孵育一段时间，测量培养皿中细胞的荧光强度。
[0015]本专利技术将该近红外区发光的核酸适配体功能化超小金纳米颗粒材料应用于肿瘤细胞成像和活体内肿瘤成像，与核酸适配体未功能化的超小金纳米颗粒材料相比较，具有更高的灵敏度和选择性。
[0016]进一步的：所述核酸适配体功能化金纳米颗粒材料在近红外区发光，检测使用的浓度为10
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200nM，检测时间为1
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12h，细胞成像环境为无酚红的DMEM培养基。
[0017]进一步的：所述检测细胞为4T1细胞，而不仅限于4T1细胞。
[0018]进一步的：所述检测时激发波长范围为250
‑
550nm，发射波长范围为600
‑
1200nm。
[0019]由以上所述制备方法得到核酸适配体功能化金纳米颗粒材料进入细胞途径的研究过程，包括以下步骤：将接种有细胞密度为20％
‑
30％的细胞培养24h后，用DPBS洗涤两次后，向其中一皿中加入抑制价，孵育一段时间后，再加入核酸适配体功能化金纳米颗粒材料，另外一皿中直接加核酸适配体功能化金纳米颗粒材料，在培养基中培养不同的时间后，用共聚焦显微镜观察材料在细胞内的成像情况，并收集细胞用电感耦合等离子体质谱仪检测不同时间内细胞对材料的摄取情况。
[0020]进一步的：所述核酸适配体功能化金纳米颗粒材料在近红外区发光，检测使用的浓度为10
‑
200nM，检测时间为1
‑
12h，细胞成像环境为无酚红的DMEM培养基。
[0021]进一步的：所述检测时激发波长范围250
‑
550nm，发射波长范围600
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1200nm，细胞成像过程观察使用共聚焦成像系统，细胞摄取材料含量的检测使用电感耦合等离子体质谱仪。
[0022]由以上所述制备方法得到核酸适配体功能化金纳米颗粒材料用于检测体内肿瘤组织的方法，包括以下步骤：将核酸适配体功能化金纳米颗粒材料静脉注射至接种了皮肿
瘤模型的雌性Balb/c小白鼠上，材料在血液中循环一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.核酸适配体功能化超小发光金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下过程：将氯金酸水溶液与谷胱甘肽配体水溶液在室温下搅拌反应，反应颜色由黄色变为无色时，加入硫酰化的核酸适配体反应，然后加入硼氢化钠水溶液，搅拌反应，溶液颜色变为棕色，停止反应，然后，超滤去除未反应的底物和多余的谷胱甘肽，最后利用含有氯化镁和氯化钠的乙醇溶液去沉淀核酸适配体功能化的金纳米颗粒，去除上清液中的游离的硫酰化核酸适配体，加入缓冲液和水重新溶解沉淀，超滤浓缩后4℃条件下保存，得到核酸适配体功能化金纳米颗粒材料。2.根据权利要求1所述的硫酰化核酸适配体功能化金纳米材料的制备方法，其特征在于：所述硫酰化的核酸适配体为硫酰化AS1411，硫酰化AS1411由两个区域组成：硫代磷酸酯骨架区域可以作为前体结合区，磷酸酯骨架区域作为分子识别区，核酸适配体不仅限于AS1411。3.根据权利要求1所述的硫酰化核酸适配体功能化金纳米材料的制备方法，其特征在于：氯金酸、巯基配体混合得到的反应溶液中，初始氯金酸与谷胱甘肽的物质的量的比值为1∶0.5至1∶1；而硫酰化核酸适配体与谷胱甘肽的物质的量比值为1∶30至1∶5；再加入硼氢化钠时，初始氯金酸与硼氢化钠的物质的量的比值为1∶8至1∶20。4.根据权利要求1所述的硫酰化核酸适配体功能化金纳米材料的制备方法，其特征在于：在最后一步加入硼氢化钠后，整个反应液pH为8～12，反应温度为4
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40℃，反应时间为6
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40h；所述核酸适配体功能化金纳米颗粒材料为单分散纳米颗粒，单颗金纳米颗粒粒径为1.0～3.0nm。5.根据权利要求1所述的硫酰化核酸适配体功能化金纳米材料的制备方法，其特征在于：所述超滤和浓缩使用的超滤管的膜孔径为3
‑
50kDa，超滤与浓缩离心温度为4
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25℃，离心转数为2000
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5000rpm，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘锦斌，聂文艳，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
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