一种鉴定配体分子结合靶蛋白和结合位点的方法技术

本发明专利技术涉及一种鉴定配体分子结合靶蛋白和结合位点的方法。取蛋白质混合物溶液，加入或者不加入配体分子进行孵育后，再分别加入相同浓度的可富集的氨基酸反应探针对蛋白质上的氨基酸进行标记。由于配体分子的结合会影响靶蛋白相应结合位点附近氨基酸的反应活性，所以将标记后的肽段富集出来并通过质谱定量分析就可以实现在复杂蛋白质混合物体系中解析配体分子的结合靶蛋白以及结合位点。该方法所使用的试剂简单易得、操作简便并且不需要对药物分子进行化学修饰，其鉴定靶蛋白的灵敏度高于或者与现有的化学蛋白质组学方法相当。于或者与现有的化学蛋白质组学方法相当。于或者与现有的化学蛋白质组学方法相当。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定配体分子结合靶蛋白和结合位点的方法


[0001]本专利技术属于蛋白质组学研究方向蛋白质与配体分子相互作用
，具体涉及一种在复杂蛋白质混合物溶液中同时鉴定药物分子靶蛋白和结合位点的方法及其应用。

技术介绍

[0002]在细胞裂解液等复杂的蛋白质混合物溶液中鉴定药物分子的靶蛋白和结合位点一直是药物研究领域一个重大的挑战。了解药物分子在靶蛋白上的结合位点对基于结构的药物设计和新的治疗药物的开发具有非常重要的价值。长期以来，传统的X射线衍射方法(XRD)和冷冻电镜技术(cryo
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EM)一直是广泛使用的方法，但是由于需要依赖高度纯化的蛋白质，和较低的检测通量，该类方法已经不能满足需求。
[0003]近年来，随着质谱技术的高速发展，基于质谱的化学蛋白质组学技术开始被应用到药物靶蛋白的鉴定中。除了具有较高的通量之外，这些技术对蛋白质样品的纯度没有太高的要求，甚至可以在复杂的细胞裂解液中发挥作用。基于活性的蛋白质组分析(Activity
‑
Based Probe Profiling,ABPP)(The本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定配体分子结合靶蛋白和结合位点的方法，其特征在于：利用配体分子结合在靶蛋白上会影响该结合位点附近氨基酸的反应活性的原理，并且这种反应活性的变化可以通过可富集的氨基酸反应探针结合质谱定量技术识别出来，从而在蛋白质混合物体系中实现对配体分子靶蛋白和结合位点的鉴定；具体为，利用加入配体组和空白组的靶蛋白的配体结合区域的氨基酸反应活性不同的原理，使用一个可富集的氨基酸反应探针并且结合基于质谱的定量蛋白质组学技术去识别这种配体引起的氨基酸反应活性的变化，从而实现在蛋白质混合物体系中对配体分子靶蛋白和结合位点的鉴定。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法的步骤为：(a)蛋白质混合物样品分为两组及以上组，一组及以上组与溶于溶剂中的配体分子进行孵育，作为配体组，另一组与等体积的空白溶剂孵育，作为空白组；(b)于配体组和空白组中分别加入相同终浓度的可富集的氨基酸反应探针对蛋白质上的氨基酸进行标记；(c)终止标记反应，并分别进行蛋白质酶切、标记肽段富集和质谱定量分析以分别获得配体组和空白组中所含有的肽段的序列信息和丰度信息；(d)将配体组和空白组的共同鉴定到的标记肽段的丰度进行比对，筛选出配体分子的结合靶蛋白和结合位点。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(a)所述的蛋白质混合物样品可以是细胞提取液、组织提取液、血液、尿液等蛋白质混合物或者纯化的蛋白质等中的一种或多种；所述的蛋白质样品必须保持蛋白质完整的天然结构，不能发生变性；从细胞和/或组织样品中提取蛋白质获取细胞提取液和/或组织提取液时，应采取一些温和的提取蛋白质的方法，包括：液氮反复冻融法、液氮研磨法或匀浆法中的一种或两种以上；从细胞和/或组织样品中提取蛋白质时所用的裂解液也应该能够维持蛋白质的结构，包括磷酸缓冲液(PBS)。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(a)所述的配体分子可以是小分子药物(如甲氨蝶呤或格尔德霉素等中的一种或两种以上)、代谢物(如三磷酸腺苷(ATP)或氨基酸等中的一种或两种以上)、核酸分子(如DNA或RNA等中的一种或两种以上)、金属离子(如Zn
2+
，Ca
2+
或Mg
2+
等中的一种或两种以上)、纯化的蛋白质以及其它可能与蛋白质混合中的蛋白质物发生相互作用的各类分子中的一种或两种以上。5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(a)所述的蛋白质溶液被平均分为两组，其中一组加入溶于溶剂的配体分子作为配体组，另一组加入与含有配体分子的溶剂等体积的空白溶剂作为空白组，进行孵育；但不局限于两组，它们可以分别被分为一组或两组以上，两组以...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶明亮，阮成飞，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：