通过LC-MS检测DNA中5-氟脱氧胞苷修饰丰度的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，涉及通过LC

【技术实现步骤摘要】
通过LC
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MS检测DNA中5
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氟脱氧胞苷修饰丰度的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种通过LC
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MS检测DNA中5
‑
氟脱氧胞苷修饰丰度的方法。

技术介绍

[0002]基因(Gene)的表达调控主要分为转录水平调控和表观水平调控，表观遗传是指生物体在不改变核DNA序列的前提下影响个体发育并且是可遗传的，主要涉及DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA和RNA甲基化等。不同于孟德尔的经典遗传学，基因功能的变化并不是由于基因序列的改变引起的。表观遗传调控作物重要农艺性状及提高抗逆性有着重要的意义，鉴定新的表观修饰可望为提高作物产量和抗逆性提供基因资源和理论基础。
[0003]表观遗传学是在研究与经典的孟德尔遗传学遗传法则不相符的许多生命现象过程中逐步发展起来的，是对经典遗传学的补充和进一步发展。基因组DNA序列所提供的遗传信息和基因组DNA上的修饰信息，这两种信息相互作用、保持平衡。细胞核个体的表现型受到自身基因转录的影响，因此可遗传的转录能提高表观遗传效应。染色质是DNA和组蛋白结合的复合体，DNA缠绕着组蛋白球体，若DNA缠绕组蛋白的方式发生改变，基因表达也将改变。
[0004]DNA甲基化是一种基因转录的重要的调节器，许多证据已经证实，异常的DNA甲基化与不定期的基因沉默有关，若在启动子区域具有高水平的5
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甲基胞嘧啶，将发生基因沉默。细菌广泛利用DNA甲基化的表观遗传，控制DNA
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蛋白的相互作用。DNA甲基化在基因组功能的表观遗传调控上发挥重要作用。
[0005]DNA甲基化5mC修饰被广泛研究，其多为沉默相关基因表达，多分布在异染色质区域和转座子区域。随着检测手段和测序技术的发展，除5mC修饰之外，人们陆续在DNA水平上检测到6mA修饰，5hmC修饰、4mC修饰以及5
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甲酰基
‑2’‑
脱氧胞嘧啶核苷修饰，这些修饰参与基因的表达调控并影响生长发育过程。5
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氟脱氧胞苷(5
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Fluoro
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2'
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deoxycytidine，FdCyd)是一种氟嘧啶核苷类似物(CAS No:10356
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76
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0)，是DNA甲基转移酶(DNMT1)抑制剂，可以有效的抑制DNA甲基化5mC修饰，目前已作为肿瘤选择性前药。在体内FdCyd可以被胞苷脱氨酶迅速转化为5
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氟脱氧尿苷(FdUrd)，随后代谢为5
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氟尿嘧啶(FU)。通过LC
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MS/MS可以在人类血浆中检测到FdCyd，但在DNA水平上还未被检测到该修饰的存在。
[0006]本研究目的是开发和验证一种定量测定玉米DNA中FdCyd的分析方法。我们使用DNA消化成单核苷酸完成提取步骤，然后通过质谱对FdCyd进行定性，并通过色谱对玉米亚热带和热带自交系品种DNA FdCyd进行定量分析。我们的检测方法使用了两种离子峰对FdCyd进行了准确的定性，进一步提高了对FdCyd检测的准确性。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的一个技术问题是如何检测DNA中5
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氟脱氧胞苷修饰丰度。
[0008]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种检测DNA中5
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氟脱氧胞苷修饰丰度的方法，包括如下步骤：
[0009]S1、提取生物样本的DNA，进行单核苷酸制备，进一步去磷酸化，然后纯化单核苷酸，得到上机样本；
[0010]S2、进行液相色谱
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质谱法检测，采用外标法对所述上机样本中的5
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氟脱氧胞苷含量和脱氧胞嘧啶核苷含量分别进行定量，以5
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氟脱氧胞苷含量除以脱氧胞嘧啶核苷含量，获得所述生物样本的DNA中5
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氟脱氧胞苷修饰丰度；
[0011]所述5
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氟脱氧胞苷含量根据在碰撞能量为5V,m/z为246.0
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129.9的离子峰和碰撞能量为35V,m/z为246.0
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112.9的离子峰对应的色谱峰进行定量；
[0012]所述脱氧胞嘧啶核苷含量根据在碰撞能量为6V,m/z为228.2
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112.1的离子峰对应的色谱峰进行定量。
[0013]上述方法中，所述液相色谱
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质谱法检测中，液相色谱采用的流动相由A相和B相组成，所述A相为体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液(溶剂为水，溶质为甲酸)，B相为甲酸体积百分含量为0.1％甲酸的乙腈溶液(溶剂为乙腈，溶质为甲酸)；液相色谱采用的洗脱程序如下：从0min到15.3min，流动相中的A相占流动相的体积比由100％线性下降至99％；从大于15.3min到20min，流动相中的A相占流动相的体积比由小于99％线性下降至94％；从大于20min到30min，流动相中的A相占流动相的体积比由小于94％线性下降至0％；从大于30到41min，流动相中的A相占流动相的体积份数由大于0％线性上升至100％。
[0014]上述方法中，所述液相色谱采用的色谱柱为Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ reverse phase column，柱长为100mm，柱内径为2.1mm,填料的粒径为1.9um；所述色谱柱的柱温为25℃，流动相的流速为0.3ml/min；所述5
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氟脱氧胞苷的色谱峰的保留时间为4.2
±
1min分钟；所述脱氧胞嘧啶核苷的色谱峰的保留时间为2.2
±
1min分钟。
[0015]上述方法中，所述单核苷酸制备在如下反应体系中进行：所述DNA的含量为500ng/300μl、腺苷脱氨酶抑制的含量为0.005μg/μl、四氢尿苷的含量为0.05μg/μl、抗氧化剂的含量为0.1mM、2，6
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二叔丁基对甲基苯酚的含量为0.1mM、核酸酶P1的含量为1U、磷酸二酯酶I的含量为0.01U、乙酸钠的含量为0.1mM、ZnCl2的含量为0.0067mM，余量为水。
[0016]上述方法中，所述单核苷酸制备的反应条件为37℃、3小时。
[0017]上述方法中，所述去磷酸化利用碱性磷酸酶进行。
[0018]上述方法中，所述去磷酸化的反应条件为37℃、1小时。
[0019]上述方法中，所述纯化单核苷酸采用截留分子量为10kDa的超滤管进行。
[0020]本专利技术还提供液相色谱法检测DNA中5
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氟脱氧胞苷修饰丰度的方法，包括如下步骤：
[0021]S1、提取生物样本的DNA，进行单核苷酸制备，进一步去磷酸化，然后纯化单核苷酸，得到上机样本；
[0022]S2、进行液相色谱法检测，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.液相色谱
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质谱法检测DNA中5
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氟脱氧胞苷修饰丰度的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、提取生物样本的DNA，进行单核苷酸制备，进一步去磷酸化，然后纯化单核苷酸，得到上机样本；S2、进行液相色谱
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质谱法检测，采用外标法对所述上机样本中的5
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氟脱氧胞苷含量和脱氧胞嘧啶核苷含量分别进行定量，以5
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氟脱氧胞苷含量除以脱氧胞嘧啶核苷含量，获得所述生物样本的DNA中5
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氟脱氧胞苷修饰丰度；所述5
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氟脱氧胞苷含量根据在碰撞能量为5V，m/z为246.0
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129.9的离子峰和碰撞能量为35V，m/z为246.0
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112.9的离子峰对应的色谱峰进行定量；所述脱氧胞嘧啶核苷含量根据在碰撞能量为6V，m/z为228.2
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112.1的离子峰对应的色谱峰进行定量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液相色谱
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质谱法检测中，液相色谱采用的流动相由A相和B相组成，所述A相为甲酸体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液，B相为体积百分含量为0.1％甲酸的乙腈溶液；液相色谱采用的洗脱程序如下：从0min到15.3min，流动相中的A相占流动相的体积比由100％线性下降至99％；从大于15.3min到20min，流动相中的A相占流动相的体积比由小于99％线性下降至94％；从大于20min到30min，流动相中的A相占流动相的体积比由小于94％线性下降至0％；从大于30到41min，流动相中的A相占流动相的体积份数由大于0％线性上升至100％。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述液相色谱采用的色谱柱为Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ reverse phase column，柱长为100mm，柱内径为2.1mm,填料的粒径为1.9um；所述色谱柱的柱温为25℃，流动相的流速为0.3ml/min；所述5
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氟脱氧胞苷的色谱峰的保留时间为4.2
±
1min分钟；所述脱氧胞嘧啶核苷的色谱峰的保留时间为2.2
±
1min分钟。4.根据权利要求1
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3任一所述的方法，其特征在于：所述单核苷酸制备在如下反应体系中进行：所述DNA的含量为500ng/300μl、腺苷脱氨酶抑制的含量为0...

【专利技术属性】
技术研发人员：普莉，张道磊，乐亮，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：