用于分析生物样品的连接子、标记物和方法技术

提供了一种用于分析生物样品的连接子(100)，其包含被配置成直接或间接结合目标分子(104)的至少一个第一亲和试剂(102)；连接到所述第一亲和试剂(102)并包含至少一个第一亲和相互作用物(110)的骨架(106)；其中所述第一亲和相互作用物(110)被配置成特异性结合包含标签(114)的第二亲和相互作用物(112)，以将所述标签(114)结合到所述骨架(106)；其中所述骨架(106)包含切割位点(108)以用于不可逆地分离所述第一亲和试剂(102)和具有所述标签(114)的所述第一亲和相互作用物(110)。在进一步的方面，提供了用于分析生物样品的标记物和方法。方法。方法。

【技术实现步骤摘要】
用于分析生物样品的连接子、标记物和方法


[0001]本专利技术涉及用于分析生物样品，特别是用于生物样品的成像分析的连接子(connector)、标记物(marker)和方法。

技术介绍

[0002]为了解决生命科学领域的关键问题，准确识别和定位生物样品(例如组织样品或细胞培养物)中的某些结构或目标分子至关重要。这可以通过在样品中引入仅与特定结构(例如特定生物分子)结合的标记物来完成。这些标记物通常包含仅连接至所讨论结构的亲和试剂和直接缀合至亲和试剂或通过其他方式(例如第二亲和试剂)连接至亲和试剂的一种或多种荧光染料或标签(label)。
[0003]例如，荧光显微镜允许以高空间分辨率对样品进行成像，但通常只涉及少数的不同荧光染料，通常在1至5种之间。在同一实验中，可用的染料必须分配给用于识别细胞类型的所有标记物，功能标记物(如感兴趣的蛋白质)和一般的形态标记物。这意味着只有有限数量的结构可以被独特的荧光染料标记并因此同时被识别。这进一步意味着在大多数成像实验中只能很差地识别不同的细胞类型。虽然存在允许更可靠和稳健地识别细胞类型的现代方法，例如基于基因调节网络(GRN)的分析，但它们需要从样品中读出更多数量的不同标记物。虽然文献PCT/EP2021/066645和PCT/EP2021/073819公开了同时利用大量荧光分子分析生物样品的方法，但生成具有不同亲和力和具有不同荧光特性的标签的多组标记物仍然耗时且昂贵。

技术实现思路

[0004]一个目的是提供用于分析生物样品的连接子、标记物和方法，其允许以低成本和时间消耗生成标记物并分析样品。
[0005]上述目的通过本公开的实施方案得以实现。有利的实施方案在以下描述中限定。
[0006]提供了一种用于分析生物样品的连接子，其包含被配置成直接或间接结合目标分子的至少一个第一亲和试剂；连接到第一亲和试剂并包含至少一个第一亲和相互作用物的骨架；其中第一亲和相互作用物被配置成特异性结合包含标签的第二亲和相互作用物，以将标签结合到骨架；其中骨架包含切割位点以用于不可逆地分离第一亲和试剂和具有标签的第一亲和相互作用物。标签特别地可以是光学可检测的。目标分子是生物样品的特定结构，例如生物样品的蛋白质、小分子(例如乳酸)或生物样品的mRNA分子。进一步的实例是肽、小分子、代谢物、激素、神经递质、金属离子。生物样品可以是例如组织、体液、固体活检、液体活检、胚胎(例如斑马鱼、果蝇)、模式生物(例如斑马鱼幼虫、果蝇胚胎、秀丽隐杆线虫)、细胞(例如原核生物、真核生物、古细菌)、多细胞生物(例如团藻)、悬浮细胞培养物、单层细胞培养物、3D细胞培养物(例如源自各种器官(例如肠、脑、心脏、肝脏)的球状体、类肿瘤、类器官)，任何上述物质的裂解物，或病毒。
[0007]因此，连接子依次包含：第一亲和试剂、具有切割位点的骨架和第一亲和相互作用
物。
[0008]第一亲和试剂和目标分子之间的结合特别地可以是特异性的。这意味着，第一亲和试剂仅结合目标分子。然而，当结合是间接的时，第一亲和试剂可以仅结合另一个实体，而另一个实体又仅结合目标分子。因此，在这种情况下，第一亲和试剂仅间接结合目标分子。
[0009]第一亲和相互作用物可以仅结合第二亲和相互作用物。这种结合在生理条件下可能是不可逆的。
[0010]特别地，这可以进一步克服当前解决方案的缺点，例如：特别地，本专利技术能够使用单价(第一)亲和试剂产生连接子，单价(第一)亲和试剂例如为纳米抗体、单链抗体、适体、寡核苷酸、或小分子化合物，其与包含用于染料失活的切割位点和亲和相互作用物的骨架组合，该亲和相互作用物用于介导连接子与标签的高亲和力相互作用或偶联。这种设计有很多优点，例如，可以构建完全基于肽或完全基于核苷酸的连接子，这允许它们一次性合成或从单个表达盒中表达。这使得制造特别容易，具有成本效益且可重复。归功于这种设计方案，只有标签需要使用标准偶联化学偶联到第二亲和相互作用物。然而，这可以由制造商更大规模地完成。对于(最终)用户而言，该设计在多路复用应用中具有关键优势，在多路复用应用中，用户通常需要将标签与他们打算在研究中使用的第一抗体进行偶联，第一抗体可以容易地为>100种抗体。执行>100个偶联反应是一个繁琐的手动过程，这与批次间的显着差异有关。使用本文中描述的连接子，用户可以简单地将合适的连接子用第二亲和试剂(例如第一抗体)预孵育，以将第二亲和试剂连接到连接子。这可以通过在多孔板中简单地混合连接子和抗体来执行，其可以使用标准的实验室自动化和液体处理设备(例如移液机器人或分配器)容易地自动化进行。
[0011]优选地，第一亲和试剂是纳米抗体、单域抗体、适体、小分子或寡核苷酸。这使得能够特别容易地组装连接子，并以高亲和力和特异性与目标分子结合。
[0012]更优选地，当第一亲和试剂被配置成间接结合目标分子时，连接子包含与第一亲和试剂结合的第二亲和试剂，并且第二亲和试剂被配置成(直接)结合目标分子。这使得能够特别灵活地组装和使用连接子，例如，与相同同种型的几种抗体组合。
[0013]优选地，第二亲和试剂是抗体并且第一亲和试剂被配置成结合抗体的片段可结晶区(Fc区)。这使得能够以特别高的亲和力和特异性与目标分子结合。特别地，第一亲和试剂可以是纳米抗体。
[0014]优选地，骨架包含寡核苷酸或肽。例如，骨架可以是基于DNA折纸的或纳米尺。这使得能够容易地组装和高效生产骨架。
[0015]优选地，切割位点是可光切割的切割位点。这使得能够容易地切割切割位点。
[0016]在一个优选的实施方案中，骨架在切割位点处通过位点特异性酶(例如TEV蛋白酶、半胱天冬酶(caspase，全称为半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)、Xa因子或限制酶)、切割光(例如UV光)或通过温度变化特异性地可切割。具体来说，这导致骨架的共价键被限制酶或蛋白水解酶、UV光切割；或杂交寡核苷酸骨架的解链/变性。这使得能够有效地切割切割位点。
[0017]优选地，第一亲和相互作用物和第二亲和相互作用物被配置成形成生物缀合物(bioconjugate，也称为生物共轭体)。这意味着第一亲和相互作用物和第二亲和相互作用
物可以彼此共价结合。形成生物缀合物的相互作用物对的实例是spytag/spycatcher、snooptag/snoopcatcher和dogtag/dogcatcher。这使得第一亲和相互作用物和第二亲和相互作用物能够彼此牢固且特异性地结合。
[0018]优选地，第一亲和相互作用物是生物素或链霉亲和素中的一种，并且第二亲和相互作用物是生物素或链霉亲和素中的另一种。这使得第一亲和相互作用物和第二亲和相互作用物能够彼此牢固且特异性地结合。
[0019]更优选地，连接子包含多个第一亲和相互作用物，每个第一亲和相互作用物结合一个第二亲和相互作用物。
[0020]优选地，标签包含至少第一荧光团。这使得能够通过光学读出装置诸如显微镜来检测标签。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于分析生物样品(500)的连接子(100)，其包含：被配置成直接或间接结合目标分子(104)的至少一个第一亲和试剂(102)，和连接到所述第一亲和试剂(102)并包含至少一个第一亲和相互作用物(110)的骨架(106)，其中所述第一亲和相互作用物(110)被配置成特异性结合包含标签(114)的第二亲和相互作用物(112)，以将所述标签(114)结合到所述骨架(106)，并且其中所述骨架(106)包含切割位点(108)以用于不可逆地分离所述第一亲和试剂(102)和所述第一亲和相互作用物(110)。2.根据权利要求1所述的连接子，其中所述第一亲和试剂(102)是纳米抗体、适体或寡核苷酸。3.根据前述权利要求中的一项所述的连接子，其中，当所述第一亲和试剂(102)被配置成间接结合所述目标分子(104)时，所述连接子包含与所述第一亲和试剂(102)结合的第二亲和试剂(212、312)，并且所述第二亲和试剂(212、312)被配置成结合所述目标分子(104)。4.根据权利要求3所述的连接子，其中所述第二亲和试剂(212、312)是抗体并且所述第一亲和试剂(102)被配置成结合所述抗体的片段可结晶区。5.根据前述权利要求中的一项所述的连接子，其中所述骨架(106)包含寡核苷酸或肽。6.根据前述权利要求中的一项所述的连接子，其中所述切割位点(108)是可光切割的切割位点。7.根据前述权利要求中的一项所述的连接子，其中所述骨架(106)在所述切割位点(108)处通过酶、切割光或温度变化特异性地可切割。8.根据前述权利要求中的一项所述的连接子，其中所述第一亲和相互作用物(110)和所述第二亲和相互作用物(112)被配置成形成生物缀合物。9.根据前述权利要求中的一项所述的连接子，其中所述第一亲和相互作用物(110)是生物素或链霉亲和素中的一种，并且所述第二亲和相互作用物(112)是生物素或链霉亲和素中...

【专利技术属性】
技术研发人员：索伦，
申请(专利权)人：莱卡微系统CMS有限责任公司，
类型：发明
国别省市：