重楼皂苷II在诱导KLF9表达水平上的应用制造技术

本发明专利技术公开了重楼皂苷II在诱导KLF9表达水平上的应用。本发明专利技术使用重楼皂苷II促进转录因子KLF9的表达，进而与GSDME的启动子区域结合发挥转录调控作用，诱导肝癌细胞焦亡效应蛋白GSDME的活化，引起肝癌细胞发生焦亡。本发明专利技术公开了转录因子KLF9介导重楼皂苷II诱导肝癌细胞焦亡效应蛋白GSDME的活化机制，为肝癌的治疗提供新的潜在靶点，从而为开发基于细胞焦亡的抗癌新药提供理论和实验依据。亡的抗癌新药提供理论和实验依据。亡的抗癌新药提供理论和实验依据。

【技术实现步骤摘要】
重楼皂苷II在诱导KLF9表达水平上的应用


[0001]本专利技术涉及肿瘤治疗领域，具体涉及重楼皂苷II在诱导KLF9表达水平上的应用。

技术介绍

[0002]原发性肝癌是目前我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因，严重威胁我国人民的生命和健康。肝癌治疗领域的特点是多学科参与、多种治疗方法共存。传统中药来源的有效单体成分是原创新药研发的重要资源，大多具有良好的抗癌活性，具有成分结构清楚，来源丰富，易于研究，活性多样等特点，更加符合精准医疗和靶向治疗的观点。
[0003]重楼皂苷是抗癌中药七叶一枝花的主要活性成分，重楼皂苷II(polyphyllin II，PPII)是一种抗肿瘤活性很强的小分子化合物，前期实验结果证实重楼皂苷II诱导的肝癌细胞死亡方式为细胞焦亡。细胞焦亡(pyroptosis)是一种促炎性的程序性死亡形式，与细胞凋亡和细胞坏死有一定的区别。焦亡主要依赖于效应蛋白gasdermin家族成员的切割，形成质膜孔，导致细胞不断胀大直至膜发生破裂，并伴有大量炎症因子的释放。
[0004]Kr
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ppel样因子9(Kr
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ppel
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like factor 9；KLF9)能够特异地结合基本转录元件，所以被称作基本转录元件结合蛋白，是SP/KLF(specifieity protein/Kr
ü
ppel
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like factor)转录因子家族成员之一。KLF9基因位于人类基因组的第9号染色体，含有2个外显子，其编码区有735个碱基，最终翻译形成含有244个氨基酸的蛋白。基于启动子区域的结合研究和寡核苷酸筛选，KLF9含有一个保守的α
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螺旋基序AA/VXXL，该基序介导其与组蛋白去乙酰酶依赖性共阻遏物(Sin3A)结合并作为转录抑制因子发挥作用。KLF9在正常肝脏组织中表达量较高，但肿瘤细胞中表达量较低。有研究表明，通过特异性提高KLF9的蛋白表达水平，能够有效抑制肝癌细胞的生长和诱导肝癌细胞死亡，这提示KLF9作为肿瘤抑制因子在肝癌发生发展过程中起抑制作用。KLF9能够通过细胞因子调节炎症反应，但其本身也受炎症因子的调控。
[0005]但是重楼皂苷II能否影响KLF9的表达以及转录因子KLF9诱导肝癌细胞焦亡效应蛋白GSDME的活化机制尚不明确。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服上述问题，深入阐明重楼皂苷II通过转录因子KLF9诱导肝癌细胞焦亡效应蛋白GSDME的活化机制，为肝癌的治疗提供新的潜在靶点，从而为开发基于细胞焦亡的抗癌新药提供理论和实验依据。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]重楼皂苷II在诱导KLF9表达水平上的应用，具体为：控制重楼皂苷II浓度改变KLF9的蛋白表达水平。
[0008]作为改进，增加使用所述重楼皂苷II的浓度，以增加KLF9的蛋白表达水平。
[0009]作为改进，所述重楼皂苷II通过调整KLF9的蛋白表达水平诱导肝癌细胞焦亡效应蛋白GSDME的活化，进而促使肝癌细胞发生焦亡。
[0010]作为改进，所述肝癌细胞为HepG2或Huh7细胞。
[0011]作为改进，敲低所述KLF9基因抑制重楼皂苷II诱导的GSDME的活化。
[0012]作为改进，所述转录因子KLF9结合在细胞焦亡关键基因GSDME转录起始位点上游183bp
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198bp和1375bp
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1390bp区域。
[0013]作为改进，所述重楼皂苷II用于制作通过改变KLF9表达水平治疗肝癌的药物。
[0014]作为改进，所述药物为针剂或口服药。
[0015]作为改进，所述重楼皂苷的浓度为1.5
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30μmol/L。
[0016]本专利技术的优点在于：
[0017]本专利技术公开了重楼皂苷II通过转录因子KLF9诱导肝癌细胞焦亡效应蛋白GSDME的活化机制，为肝癌的治疗提供新的潜在靶点，从而为开发基于细胞焦亡的抗癌新药提供理论和实验依据。
附图说明
[0018]图1为重楼皂苷II对人肝癌细胞系及正常细胞系的毒性分析，其中A、B、C、D分别为重楼皂苷II处理肝癌细胞HepG2、Huh7、Hep3B、SMMC
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7721不同时间的细胞活力曲线，E为重楼皂苷II处理肝正常细胞LO2不同时间的细胞活力曲线，F为重楼皂苷II与5
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氟尿嘧啶和顺铂的早期作用于肝癌HepG2细胞活力曲线；
[0019]图2为平板克隆实验检测重楼皂苷II对HepG2和Huh7细胞克隆形成能力的影响(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001)；
[0020]图3为Edu实验检测重楼皂苷II对HepG2和Huh7细胞增殖的影响(*P＜0.05；**P＜0.01)；
[0021]图4为重楼皂苷II引起肝癌细胞死亡比例关系图，其中，A、B分别为HepG2和Huh7细胞的CalceinAM/PI染色荧光图，C、D分别为HepG2和Huh7细胞的AnnexinV
‑
FITC/PI流式图；
[0022]图5表明细胞焦亡抑制剂可减缓重楼皂苷II对肝癌细胞的生长抑制作用，其中，A、C为凋亡抑制剂和坏死抑制剂对重楼皂苷II所引起的肝癌细胞生长抑制的影响；B、D为焦亡抑制剂对重楼皂苷II所引起的肝癌细胞生长抑制的影响；
[0023]图6为重楼皂苷II诱导肝癌细胞焦亡相关指标特征性改变图片，其中，A、B为重楼皂苷II引起肝癌细胞形态学改变的图像；C、D为重楼皂苷II诱导GSDME的切割；E为GSDME与免疫细胞相关性分析；F、G为重楼皂苷II引起炎性细胞因子IL
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18释放(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001)；
[0024]图7为细胞焦亡靶基因GSDME上游转录因子的预测和筛选，其中，A为靶基因上游转录因子的预测流程图，B.为GSDME位置信息；C与GSDME启动子结合的转录因子预测结果；D为ChIP
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seq数据分析转录因子KLF9与GSDME结合强度；
[0025]图8表明KLF9和GSDME表达量与肝癌预后相关，A为免疫组化分析KLF9和GSDME在癌和癌旁的差异；B、C为KLF9在肝细胞肝癌配对样本和非配对样本中癌和癌旁的表达差异；D为KLF9的表达量与肝细胞肝癌预后分析；E、F为GSDME在肝细胞肝癌配对样本和非配对样本中癌和癌旁的表达差异；G为GSDME的表达量与肝细胞肝癌预后分析(**P＜0.01；***P＜0.001)；
[0026]图9表明KLF9和GSDME在肝癌的表达水平呈负性相关，其中，A为KLF9和GSDME在肝细胞肝癌的分子相关性分析结果；B为KLF9和GSDME在肝细胞肝癌的基因共表达热图；C、D为
蛋白免疫印迹和qRT
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PCR分析KLF9在肝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重楼皂苷II在诱导KLF9表达水平上的应用，其特征在于，控制重楼皂苷II浓度改变KLF9的蛋白表达水平。2.根据权利要求1所述重楼皂苷II在诱导KLF9表达水平上的应用，其特征在于，增加使用所述重楼皂苷II的浓度，以增加KLF9的蛋白表达水平。3.根据权利要求1所述重楼皂苷II在诱导KLF9表达水平上的应用，其特征在于，所述重楼皂苷II通过调整KLF9的蛋白表达水平诱导肝癌细胞焦亡效应蛋白GSDME的活化，进而促使肝癌细胞发生焦亡。4.根据权利要求2所述重楼皂苷II在诱导KLF9表达水平上的应用，其特征在于，所述肝癌细胞为HepG2或Huh7细胞。5.根据权利要求2所述重楼皂苷II在诱导KLF9表达水平上的应用，其特征在于，敲低所述KLF9基因抑制重楼皂苷II诱导的GSDME的活化。6.根据权利要求2所述重楼皂苷I...

【专利技术属性】
技术研发人员：何志巍，吴隆吉，孔霞，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：