一种双重检测一氧化氮和粘度准确诊断肝纤维化的比率型荧光探针制造技术

本发明专利技术涉及一种双重检测一氧化氮和粘度准确诊断肝纤维化的比率型荧光探针，属于荧光探针领域。其分子结构如下：该荧光探针分子呈现红色荧光，与NO完全响应后715nm处红色荧光由减弱直至消失，发射强烈的橙色荧光，探针BDP的荧光强度比(I

【技术实现步骤摘要】
一种双重检测一氧化氮和粘度准确诊断肝纤维化的比率型荧光探针
[0001]本专利技术涉及一种双重检测一氧化氮和粘度准确诊断肝纤维化的比率型荧光探针BDP，包含合成步骤，荧光光谱测试及在生物成像领域的应用，属于荧光探针领域。

技术介绍

[0002]肝纤维化(HF)是慢性肝病向肝硬化发展的阶段。在慢性肝病中，肝实质中出现纤维增生和分解代谢之间的失衡，产生纤维结缔组织以治疗肝损伤。然而，肝实质持续的慢性炎症和坏死导致纤维结缔组织过度堆积，导致肝纤维增生，最终导致心力衰竭。因此，心力衰竭是一个极其复杂的动态过程。由于缺乏特征性临床表现，除肝活检外，目前尚无诊断HF的具体工具。研究表明，有可能在早期阻止HF发展为肝硬化。因此，准确诊断心衰对于控制肝病的进展和治疗至关重要。研究表明，HF患者肝组织中NO和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的水平远高于健康肝组织。此外，在纤维肝细胞中观察到显著的粘度增加，这是HF进展的原因。由于NO过表达或粘度增加在其他肝病中发现，单独检测其中任何一种都可能导致错误诊断。因此，同时检测肝组织中的NO和粘度有助于在早期准确诊断HF，也有助于进一步深入了解HF的体内机制。荧光探针因其高灵敏度、快速响应和无创检测等优点而在过去十年中蓬勃发展。与关闭荧光探针相比，比率测量探针更可取，因为其精度高。此外，具有长波长光谱的荧光探针是优选的，因为长波长光可以深度穿透生物组织。值得注意的是，多因子响应探针比单因子响应探针更准确和可靠，因为前者可以避免多种疾病中一种因子表达产生的虚假信号。近年来开发了许多用于分别检测NO或粘度的荧光探针。迄今为止，只有一种荧光探针用于检测NO和粘度，其显示了细胞中NO(绿色信号)和粘度(蓝色信号)的开启荧光响应。事实上，无论介质有多粘稠，该探针只发出绿色荧光，无法同时监测NO和粘度。因此，研制一种长波长、定量荧光探针来有效地检测NO和粘度对于准确诊断HF具有重要意义。在本专利中，构建了比率荧光探针BDP，以检测过表达的NO和高粘度，用于HF诊断。该分子中富含电子的芳香族仲胺被视为NO反应基团，其利用N
‑
亚硝基化来调节推挽系统以进行比率成像。假设在低粘度下，N
‑
甲基苯胺和BODIPY部分之间的C＝C键自由旋转，从而显示出探针的低荧光强度。纤维化肝脏的高粘性环境限制了分子内旋转，从而增强了荧光信号。NO可以与探针BDP反应，导致从仲胺到N
‑
亚硝基化的快速转变，伴随着荧光从红色变为橙色。高粘度导致探针响应NO前后显著的荧光增强。通过监测NO浓度变化和粘度增强，预计探针BDP将是HF检测的一个有前途的工具。

技术实现思路

[0003]本专利技术目的在于针对现有研究的不足，开发出一种双重检测一氧化氮和粘度准确诊断肝纤维化的比率型荧光探针，解决了现有比率型型荧光探针不能对活性物种NO与粘度同时区分检测的技术难题。所述荧光探针BDP具有如下结构式：
合成路线如下：(a)将化合物1和化合物2溶于无水甲苯中，然后向混合物中加入乙酸，加哌啶做碱催化，在120℃下加热回流反应5h后，将混合物冷却至室温后，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压旋干后得到粗产品，柱层析纯化得到化合物BDP。技术路线为：所述步骤(a)中5,5
‑
二氟
‑
1,3,7,9
‑
四甲基
‑
10
‑
苯基
‑
5H
‑
4l4,5l4
‑
二吡咯并[1,2
‑
c:2'，1'
‑
f][1,3,2]二氮硼烷、4
‑
(甲胺基)苯甲醛物质的量比为1：1.625。所述步骤(a)中柱层析采用的洗脱剂为(V石油醚:V乙酸乙酯＝3/1)。
[0004]本专利技术的荧光探针测试方法如下；将探针分子溶解在DMSO/PBS(3:7,v/v,10mM,pH＝7.40)中，室温下进行测试。可以对NO和粘度进行定性、定量检测，具体实施方法在实施实例中详细介绍。
[0005]本专利技术的荧光探针的响应机理如下：探针BDP富含电子的芳香族仲胺被视为NO反应基团，其利用N
‑
亚硝基化来调节推拉电子体系以进行比率成像。假设在低粘度下，N
‑
甲基苯胺和BODIPY部分之间的C＝C键自由旋转，从而显示出探针的低荧光强度。纤维化肝脏的高粘性环境限制了分子内旋转，从而增强了荧光信号。NO可以与探针BDP反应，导致从仲胺到N
‑
亚硝基化的快速转变，伴随着荧光从红色变为橙色。高粘度导致探针响应NO前后显著的荧光增强。可以实现对NO和粘度的同时检测。
[0006]本专利技术的荧光探针母体呈现红色荧光，与NO完全响应后715nm处红色荧光由减弱直至消失，发射强烈的橙色荧光，探针BDP的荧光强度比(I
625nm
/I
715nm
)与NO浓度具有良好的线性关系；高粘度导致探针响应NO前后显著的荧光增强，实现同时响应的效果。
[0007]本专利技术所述的探针分子合成路线简单，成本较低，生物相容性好，可以实现高选择性与灵敏性检测NO和粘度。
附图说明
[0008]图1为本专利技术的荧光探针BDP在氘代氯仿中核磁共振氢谱，横坐标化学位移，纵坐标为强度。
[0009]图2为本专利技术的荧光探针BDP在氘代氯仿中核磁共振碳谱，横坐标化学位移，纵坐标为强度。
[0010]图3为本专利技术的荧光探针BDP(10μM)在PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4，30％ DMSO),与400μM的NO响应前后荧光强度比(I
625nm
/I
715nm
)随时间的变化情况。横坐标为波长，纵坐标为荧光强度比。
[0011]图4为本专利技术的荧光探针BDP(10μM)在PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4，30％ DMSO),与400μM NO响应前后紫外吸收光谱和荧光光谱变化情况(吸收光谱(实线)和荧光光谱(虚线)λex＝550nm)。横坐标为波长，纵坐标为吸光度或者荧光强度。
[0012]图5为本专利技术的荧光探针BDP(10μM)在PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4，30％ DMSO)中与相关物质(ONOO
‑
、H2O2、KO2、ROO
·
、Cys、Hcy、GSH、Cl
‑
、S2‑
、CO
32
‑
、K
+
、Mg
2+
、NO；浓度为400μM)响应后探针溶液荧光光谱的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。
[0013]图6为本专利技术的荧光探针BDP(10μM)在PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4，0
‑
70％甘油,)中，在不存在(a)和存在(b)NO时的荧光寿命衰减曲线响应后探针溶液荧光光谱的变化情况，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。
[0014]图7为荧光探针BDP(5μM本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双重检测一氧化氮和粘度准确诊断肝纤维化...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋相志，韩少辉，杨雷，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：