一种同时区分检测次氯酸和过氧化氢的比率型荧光探针制造技术

本发明专利技术公布了一种同时区分检测次氯酸和过氧化氢的比率型荧光探针，属于化学分析检测技术领域，其分子结构式如下：在检测过程中，该探针具有选择性好、灵敏度高等优点。该探针可以同时区分检测细胞及活体内的次氯酸和过氧化氢，并具有检测酒精性肝损伤中过氧化氢和次氯酸水平。这些优良的性能表明该荧光探针在环境及生物等领域具有重要的应用价值。环境及生物等领域具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种同时区分检测次氯酸和过氧化氢的比率型荧光探针


[0001]本专利技术属于化学分析检测
，具体涉及一种同时区分检测次氯酸和过氧化氢的比率型荧光探针及其在环境与生物体系中的应用。

技术介绍

[0002]活性氧作为细胞内和细胞间的重要物质，在细胞信号传递、分化、迁移、细胞免疫和机体抵御病原体等方面发挥着重要作用。活性氧物种包括单线态氧、过氧化氢、超氧自由基以及次氯酸等。其中，过氧化氢(H2O2)是报道最多的活性氧信号分子，在细胞信号转导和稳态中具有多种不可缺少的功能。当它过量时，会引起氧化损伤，与多种疾病有关，比如癌症、神经退行性疾病、炎症和心血管疾病等。次氯酸(HClO)是一种强氧化剂并具有杀菌作用，可以应对免疫系统的微生物入侵，但当生物体内次氯酸异常积累时，会引起严重的组织损伤，进而诱发一系列疾病，包括神经退行性疾病、缺血、类风湿、癌症等。在生物体中，H2O2和HClO的水平将有一个明确的正常范围，并维持动态平衡。当平衡被打破，系列疾病就会发生。因此，迫切需要能够同时检测过氧化氢和次氯酸的工具。
[0003]荧光探针技术是一种非侵入性的生物荧光成像及检测的方法，其高灵敏度及高时空分辨率的优势已经引起了科研工作者的关注。虽然有很多种类的探针可以特异性地检测过氧化氢或次氯酸，但是能够同时区分检测两者的非常罕见。此外，比率型荧光探针通过对两个荧光信号进行自校准，可以减少探针浓度、仪器因素和环境的干扰，而提高其检测的准确度。至今，能够同时区分检测次氯酸和过氧化氢比率型荧光探针非常罕见，且没有深入探究在疾病模型的应用。因此，开发能够同时区分检测次氯酸和过氧化氢，并能应用于细胞/活体组织中外源性和内源性及疾病模型中比率型荧光探针是非常有意义的。

技术实现思路

[0004]为克服现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种同时区分检测次氯酸和过氧化氢的比率型荧光探针。
[0005]本专利技术中的荧光探针，其分子结构如下：
[0006]本专利技术中的荧光探针通过以下合成路线制备：
[0007]本专利技术中的荧光探针检测机制如下：荧光探针本身发射红色荧光，与次氯酸反应后，酚噻嗪上的S原子被氧化为
‑
S＝O，探针的荧光从红色变为绿色，因此探针可以实现对次氯酸的比率型检测；当与过氧化氢反应后，硼酸酯部分脱离，香豆素部分发射出蓝色荧光，而酚噻嗪香豆素部分的红色荧光不发生变化，以红色荧光作为内标，实现对过氧化氢的比率型检测。
[0008]本专利技术的荧光探针灵敏度高。荧光探针与过氧化氢和次氯酸的荧光响应测试在25℃下PBS缓冲液(V
PBS buffer
/V
乙腈
＝7/3，pH＝7.4)中测试。探针本身在605nm处发射红色荧光，当次氯酸加入后，500nm处有绿色荧光产成(激发波长为440nm)，且随次氯酸浓度的增加，500nm处的荧光强度(I
500nm
)与605nm处的荧光强度(I
605nm
)的比值明显增大，当加入3倍量的次氯酸时，I
500nm
/I
605nm
达到最大，与空白探针溶液相比增强了352倍。同时探针与次氯酸浓度(20
‑
30μM)呈很好的线性关系，线性相关系数是0.99153。根据信噪比S/N＝3，计算出探针对次氯酸的检测限为0.064μM。当探针响应不同浓度的过氧化氢时，随过氧化氢的加入，605nm处峰值强度几乎没有变化，但随过氧化氢浓度的增加，在450nm处出现一个新峰(激发波长为360nm)，并随着过氧化氢浓度的增加而逐渐增加。当加入15倍量的过氧化氢时，探针
的荧光强度达到了平衡，I
450nm
/I
605nm
从0.15提高到1.17，提高了7.8倍。同时探针与过氧化氢浓度(0
‑
80μM)呈很好的线性关系，线性相关系数是0.99564。根据信噪比S/N＝3，计算出探针对次氯酸的检测限为2.90μM。
[0009]本专利技术的荧光探针选择性好。选择阴离子(HS
‑
，SO
32
‑
，S2O
32
‑
)，阳离子(Na
+
，K
+
，Mg
2+
，Ca
2+
)，生物硫醇(GSH，Hcy，Cys)以及活性氧(1O2，
·
OH，
·
O
t
Bu，ROO
·
，ONOO
‑
，NO)作为干扰物质，加入到探针溶液中，荧光光谱几乎没有变化。当加入次氯酸和过氧化氢时，荧光发生明显的变化。
[0010]本专利技术的荧光探针响应速度快。在与次氯酸作用后，荧光强度立即发生改变，I
500nm
/I
605nm
在3min内即可达到平衡。空白探针溶液的荧光强度在30分钟内保持不变。加入过氧化氢后，I
450nm
/I
605nm
的荧光强度比值逐渐增大，在20min内达到平衡，空白探针溶液的荧光强度比在90min内保持不变。
[0011]本专利技术的荧光探针具有较低的细胞毒性。细胞与探针(浓度小于15μM)在37℃培育24h后，存活率大于90％。
[0012]本专利技术的荧光探针能同时检测细胞中内源性的和外源性的过氧化氢和次氯酸水平。探针对细胞内外源性HClO和H2O2的荧光成像：将细胞与探针孵育20min作为对照组，细胞呈现明显的红色荧光；当细胞与次氯酸孵育20min后，再与探针孵育20min，细胞呈明显的绿色荧光；细胞先与过氧化氢孵育20min，再与探针孵育20min，细胞呈现出蓝色荧光和红色荧光；细胞先与次氯酸和过氧化氢孵育20min，再与探针孵育20min，细胞显示出较强的蓝色和绿色荧光。结果表明，该探针能够同时识别和检测细胞内的外源性次氯酸和过氧化氢。探针对细胞内内源性HClO和H2O2的荧光成像：对照组将细胞与探针(10.0μM)孵育20min，呈现红色荧光；将细胞与次氯酸孵育20min，再与探针孵育20min，可以发现细胞呈现绿色荧光；将细胞与LPS和PMA培育1h产生内源性HClO和H2O2，再与探针孵育20min，细胞内呈绿色和蓝色荧光；对照组中，细胞与LPS和PMA培育1h，再与NAC(细胞内活性氧消除剂)孵育1h，最后与探针孵育20min，细胞内呈现红色荧光。研究结果表明，本专利技术的荧光探针可以对细胞中内源性的HClO和H2O2进行检测。
[0013]本专利技术的荧光探针能同时检测斑马鱼中外源性和内源性的过氧化氢和次氯酸水平。探针对斑马鱼外源性HClO和H2O2的荧光成像：将斑马鱼与探针孵育20min作为对照组，斑马鱼呈现明显的红色荧光；当斑马鱼与次氯酸孵育20min后，再与探针孵育20min，斑马鱼呈明显的绿色荧光；斑马鱼先与过氧化氢孵育20min，再与探针孵育20min，斑马鱼呈现出蓝色荧光和红色荧光；斑马鱼先与本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时区分检测次氯酸和过氧化氢的比率型荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兴江，刘娇娇，牛培鑫，张文英，魏柳荷，李禹函，孙爱灵，刘华玉，
申请(专利权)人：河南郑大善之璞材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：