制备病毒疫苗的方法、培养用于制备疫苗的Vero细胞的方法和培养基技术

本发明专利技术提出一种制备病毒疫苗的方法、培养用于制备疫苗的Vero细胞的方法和培养基，所述培养用于制备疫苗的Vero细胞的方法包括：(a)对Vero细胞进行基因改造，以便得到基因改造的SDHB基因，(b)将经过基因改造的所述Vero细胞在经过优化的MEM培养基中进行无血清培养，以便获得用于制备疫苗的Vero细胞。通过采用根据本申请实施例的技术方案，能够有效地对经过SDHB基因改造的Vero细胞进行培养，从而进一步可以用于扩增PEDV病毒和制备疫苗。可以用于扩增PEDV病毒和制备疫苗。可以用于扩增PEDV病毒和制备疫苗。

【技术实现步骤摘要】
制备病毒疫苗的方法、培养用于制备疫苗的Vero细胞的方法和培养基


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体的，本申请涉及细胞培养和疫苗领域，本专利技术涉及制备病毒疫苗的方法、培养用于制备疫苗的Vero细胞的方法和培养基。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻病毒(学名：Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)，又称猪流行性下痢病毒，是甲型冠状病毒属的一种病毒，可感染猪，造成猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhoea)，其症状包括严重的小肠炎、呕吐、腹泻与脱水等，在新生的小猪中特别严重。PEDV给养猪业造成巨大危害的主要原因是缺少高效的PEDV疫苗，而制备高效疫苗的基本条件是获得高滴度的病毒。
[0003]目前生产PEDV疫苗所使用细胞系为Vero细胞，存在培养病毒滴度较低的缺陷。因此，目前关于采用Vero细胞扩增PEDV病毒的手段仍有待改进。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种能够有效地扩增PEDV病毒的手段。
[0005]在本申请的第一方面，本专利技术提出了一种培养用于制备疫苗的Vero细胞的方法，其包括：(a)对Vero细胞进行基因改造，以便得到基因改造的SDHB基因，(b)将经过基因改造的所述Vero细胞在经过优化的MEM培养基中进行无血清培养，以便获得用于制备疫苗的Vero细胞，其中，所述基因改造的SDHB基因表达具有下列氨基酸序列的SDHB蛋白：
[0006]MAAVVALSLRGALPATTLGGAALQASRGAQTAAAAAPRIKKFAIYRWAPDKAGDAPHAQTYEIDLNKCGPMVLDALIKIKNEIDSTLTFRRSCREGICGSCAMNINGGNTLACTRRIDTNLNKVSKIYPLPHMYVIKDLVPDLSNFYAQYKSIEPYLKKKDESQEGKQQYLQSIEEREKLDGLYECILCACCSTSCPSYWWNGDKYLGPAVLMQAYRWMIDSRDDFTEERLAKLQDPFSLYRCHTIMNCTRTCPKGLNPGKAIAEIKKMMATYKEKKASV(SEQ ID NO:1)，
[0007]所述经过优化的MEM培养基是在基础MEM培养基中额外添加下列成分：
[0008]M
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丙氨酸、L
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盐酸精氨酸、L
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天门冬氨酸、L
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门冬酰胺、L
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半胱氨酸盐酸盐一水、L
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胱氨酸二盐酸盐、L
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谷氨酸、L
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谷氨酰胺、甘氨酸、L
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盐酸组氨酸一水、L
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羟脯氨酸、L
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异亮氨酸、L
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亮氨酸、L
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盐酸赖氨酸、L
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甲硫氨酸、L
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苯丙氨酸、L
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脯氨酸、L
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丝氨酸、丙氨酰谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES、大豆水解物、酵母提取物、无水磷酸氢二钠、D
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无水葡萄糖、还原型谷胱甘肽、七水硫酸亚铁、七水硫酸锌、维生素C、氯化胆碱、肌醇、九水硝酸铁、氯化锂、重组人胰岛素、柠檬酸铁、维生素B12、五水硫酸铜、六水氯化镁、D
‑
生物素、次黄嘌呤、亚油酸、硫辛酸、1，4
‑
丁二胺二盐酸盐、维生素B2、胸苷、对氨基苯甲酸、氯化铝、乙酸钡、六水氯化钴、四水氯化锰、氟化钠、氯化亚锡、氯化镉、二氧化锗、亚硒酸钠、九水偏硅酸钠、氯化镍、偏钒酸铵、胆固醇、维生素E、维生素A醋酸酯、烟酸、2D
‑
脱氧核糖、氢化可的松、EGF和IGF。
[0009]上述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中“加粗和下划线”标记的氨基酸为相较于野
生型SDHB经过改造(突变)的氨基酸位点，其中，各氨基酸位点发生的突变为R12A、C22A、D48A、K55A、M58A。
[0010]需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：
[0011]本申请的专利技术人在使用Vero细胞生产PEDV相关疫苗的研究过程中发现可以通过对Vero细胞的某些基因进行改造来提高PEDV病毒感染Vero细胞的效率，从而可以提高Vero细胞生产PEDV疫苗的效率。由此，本申请的专利技术人对多种候选基因进行实验后，意外地发现了通过使SDHB基因的功能下调，能够提高PEDV对Vero细胞的感染效率。由此，专利技术人进一步对SDHB基因的改造方式进行研究，发现如果将SDHB全部敲除或者功能完全丧失，则Vero细胞的生长行为会受到严重影响，不利于在Vero细胞上对PEDV进行扩增，专利技术人进行深入研究后提出了采用特定突变类型的SDHB可以在不影响Vero细胞生长行为的情况下提高PEDV对Vero细胞的感染效率。在获得PEDV感染率高的Vero细胞后，专利技术人遇到了新的技术问题，即SDHB基因改造后，Vero细胞在常规培养基例如MEM培养基的生长速率有所降低，为此，专利技术人进一步研究了多种现有的培养基，最后确定了对MEM培养基进行优化的研究路线，经过对MEM的培养基添加一系列添加物，经过大量实验筛选和优化提出了一种新型的培养基，可以对经过改造后的Vero细胞进行高效率无血清培养，由此，完成了本专利技术。
[0012]根据本申请的实施例，专利技术人提出病毒在侵染及增殖过程中会与宿主发生互作，互作的核心在于竞争有限的代谢中间体与能量，细胞通过代谢重排维系二者代谢关系。琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase，SDH)作为TCA循环与电子传递的关键酶，在天然免疫反应和细胞的代谢重排中发挥重要作用。专利技术人发现不同病毒感染对SDH活性的影响截然不同，例如，新城疫病毒在细胞中的增殖抑制了SDH活性，而牛疱疹病毒1型感染细胞会增强细胞内SDH的表达。本申请的专利技术人发现抑制SDH活性会提高PEDV在细胞中的增殖效率，因此本专利技术利用基因编辑技术对Vero细胞系中的多种SDH活性位点进行改造和筛选比较，获得能够提高PEDV复制效率的细胞系。SDH包括A、B、C、D 4个编码基因，本专利技术的专利技术人经过大量筛选工作，最终确定编码SDH琥珀酸脱氢酶中B亚基的SDHB基因作为改造的对象。通过采用根据本申请实施例的技术方案，能够有效地对经过SDHB基因改造的Vero细胞进行培养，从而进一步可以用于扩增PEDV病毒和制备疫苗，并且采用该培养基得到的疫苗不存在污染外源病毒和致病因子的风险，避免了接种者的过敏反应，并且不同批次培养过程中的生物活性和因子的一致性高。
[0013]根据本申请的实施例，上述培养用于制备疫苗的Vero细胞的方法还可以具有下列附加技术特征中的至少之一：
[0014]根据本申请的实施例，所述SDHB基因具有下列核苷酸序列：
[0015]CCCTC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养用于制备疫苗的Vero细胞的方法，其特征在于，包括：(a)对Vero细胞进行基因改造，以便得到基因改造的SDHB基因，(b)将经过基因改造的所述Vero细胞在经过优化的MEM培养基中进行无血清培养，以便获得用于制备疫苗的Vero细胞，其中，所述基因改造的SDHB基因表达具有下列氨基酸序列的SDHB蛋白：MAAVVALSLRGALPATTLGGAALQASRGAQTAAAAAPRIKKFAIYRWAPDKAGDAPHAQTYEIDLNKCGPMVLDALIKIKNEIDSTLTFRRSCREGICGSCAMNINGGNTLACTRRIDTNLNKVSKIYPLPHMYVIKDLVPDLSNFYAQYKSIEPYLKKKDESQEGKQQYLQSIEEREKLDGLYECILCACCSTSCPSYWWNGDKYLGPAVLMQAYRWMIDSRDDFTEERLAKLQDPFSLYRCHTIMNCTRTCPKGLNPGKAIAEIKKMMATYKEKKASV(SE ID NO:1)，所述经过优化的MEM培养基是在基础MEM培养基中额外添加下列成分：L
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丙氨酸、L
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盐酸精氨酸、L
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天门冬氨酸、L
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门冬酰胺、L
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半胱氨酸盐酸盐一水、L
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胱氨酸二盐酸盐、L
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谷氨酸、L
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谷氨酰胺、甘氨酸、L
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盐酸组氨酸一水、L
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羟脯氨酸、L
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异亮氨酸、L
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亮氨酸、L
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盐酸赖氨酸、L
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甲硫氨酸、L
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苯丙氨酸、L
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脯氨酸、L
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丝氨酸、丙氨酰谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES、大豆水解物、酵母提取物、无水磷酸氢二钠、D
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无水葡萄糖、还原型谷胱甘肽、七水硫酸亚铁、七水硫酸锌、维生素C、氯化胆碱、肌醇、九水硝酸铁、氯化锂、重组人胰岛素、柠檬酸铁、维生素B12、五水硫酸铜、六水氯化镁、D
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生物素、次黄嘌呤、亚油酸、硫辛酸、1，4
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丁二胺二盐酸盐、维生素B2、胸苷、对氨基苯甲酸、氯化铝、乙酸钡、六水氯化钴、四水氯化锰、氟化钠、氯化亚锡、氯化镉、二氧化锗、亚硒酸钠、九水偏硅酸钠、氯化镍、偏钒酸铵、胆固醇、维生素E、维生素A醋酸酯、烟酸、2D
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脱氧核糖、氢化可的松、EGF和IGF。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SDHB基因具有下列核苷酸序列：CCCTCCGCCCACTCGGGAAACCGGAAGCCGCCTCCCACTCGGTGGCTCCTACGCGGCTAGCGGGTCCTCAGTGGATGCAGGCTGGGCGCCGCGATGTTCGACGGGACATCGGCGGAGAGAGACCTCGGGGTTAAGGGGTGGGGCTGACGTCAAGAGCCAAGATGGCGGCGGTGGTCGCACTCTCCTTGAGGGGCgccTTACCGGCCACAACCCTTGGCGGAGCCgccCTGCAGGCCTCCCGAGGAGCCCAGACAGCTGCAGCCGCAGCTCCCCGTATCAAGAAATTTGCCATCTATCGATGGgctCCAGACAAGGCTGGAGACgctCCTCATATGCAGACTTACGAAATTGACCTTAATAAATGTGGCCCCATGGTATTGGATGCTTTAATCAAGATTAAGAATGAAATTGACTCTACTTTGACCTTCCGAAGATCATGCAGAGAAGGCATCTGTGGCTCTTGTGCAATGAACATCAATGGAGGCAACACTCTAGCTTGCACCCGAAGGATTGACACCAACCTCAATAAGGTCTCAAAAATCTACCCTCTTCCACATATGTATGTGATAAAGGACCTTGTTCCCGATTTGAGCAACTTCTATGCTCAGTACAAATCCATTGAGCCTTATTTGAAGAAGAAGGATGAATCTCAGGAAGGCAAGCAGCAGTATCTGCAGTCCATAGAAGAGCGTGAGAAACTGGACGGGCTCTACGAGTGCATTCTCTGTGCCTGCTGTAGCACCAGCTGCCCCAGCTACTGGTGGAACGGAGACAAATATCTGGGGCCTGCAGTTCTTATGCAGGCCTATCGCTGGATGATTGACTCCAGAGACGACTTCACAGAGGAGCGCCTGGCCAAGCTGCAGGACCCGTTCTCTCTGTACCGCTGCCACACCATCATGAACTGCACAAGGACCTGTCCTAAGGGTCTGAATCCAGGGAAAGCTATTGCAGAAATCAAGAAAATGATGGCAACCTATAAGGAGAAGAAAGCTTCAGTTTAAGTGTTTCCATGCTAAACATGATTTAAAACCAGCTCAGAGCTGAACATAATTTATATCTAATTTGAGTTCCTTTAAAGATCTTGGTTTTCCATGAATACAGCATGTATAATAAAAATTTTAAGAAATAAATGTTATTCTACTTTATTAACAAAAAAA(SEQ ID NO:2)。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经过改造的MEM培养基是在基础MEM培养基中额外添加下列成分，并使得额外添加的下列成分具有以下终浓度：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述经过改造的MEM培养基是在基础MEM培养基中额外添加下列成分，并使得额外添加的下列成分具有以下终浓度：
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述基础MEM培养基含有以下终浓度的下列成分：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因改造是采用CRISPR系统进行的；任选地，所述CRISPR系统包括CRISPR Cas9；任选地，所述基因改造中，针对SEQ ID NO:1氨基酸序列所示的SDHB蛋白的第12位氨基酸突变使用的引物序列包括：SDHB
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sgRNA1
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Exon1
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F：CACCGTGGTCGCACTCTCCTTGAG(SEQ ID NO:3)，SDHB
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sgRNA1
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Exon1
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R：AAACCTCAAGGAGAGTGCGACCAC(SEQ ID NO:4)，ssDNA序列为：ATGGCGGCGGTGGTCGCACTCTCCTTGAGGGGCgccTTACCGGCCACAACCCTTGGCGGAGCCTGCCTGCAGGTGAGTCCTGGAGTCTCAGAGAGGGAAAAAGGCAGGAAAGTCACGGAGACTGCCTGGAGCTGATAGGTCCGCGGAGAG(SEQ ID NO:5)。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因改造中，针对SEQ ID NO:1氨基酸序列所示的SDHB蛋白的第22位氨基酸突变使用的引物序列包括：SDHB
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sgRNA2
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Exon1
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F：CACCGTTACCGGCCACAACCCTTGG(SEQ ID NO:6)，SDHB
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sgRNA2
‑
Exon1<...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈文庆，尹成伟，徐舸辰，赵洪磊，类成霞，王杰勇，
申请(专利权)人：中生天信和无锡生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：