一种快速检测血清样本中16种激素浓度的方法技术

本发明专利技术涉及激素检测领域，具体涉及一种快速检测血清样本中16种激素浓度的方法，所述方法包括：S1 建立校准曲线；S2 将待进样样本通过超高效液相色谱串联质谱进行检测，所述待进样样本为经前处理的血清样本，所述前处理方式包括利用包含内标物的萃取剂前处理血清样本后复溶；所述萃取剂包括乙酸乙酯和甲酸；所述质谱的条件包括：基于大气压力化学电离源，采用正负离子切换的检测模式和多反应监测的扫描模式，以及2周期3实验模式；S3 利用所述校准曲线，计算并获得所述血清样本中的所述激素的浓度。本发明专利技术提供了一种能够真实、准确地反映出患者体内的激素浓度的方法，有望应用至辅助临床医生进行疾病的初步筛查和诊断。临床医生进行疾病的初步筛查和诊断。临床医生进行疾病的初步筛查和诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测血清样本中16种激素浓度的方法


[0001]本专利技术涉及激素检测领域，具体涉及一种快速检测血清样本中16种激素浓度的方法。

技术介绍

[0002]激素在机体的内分泌、旁分泌和内分泌调节水平上起着至关重要的作用，例如皮质类固醇（例如糖皮质激素和盐皮质激素）参与多种生物过程，包括应激反应和免疫反应以及炎症和碳水化合物代谢的调节；性类固醇（例如孕激素、雄激素和雌激素）介导生殖功能和性特征的发育以及其他功能；褪黑素参与同步昼夜节律，包括睡眠
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觉醒时间、血压调节和季节性繁殖。
[0003]癫痫是以大脑神经元突发性异常放电导致短暂大脑功能障碍为突出特征的一种慢性疾病。癫痫和机体各种内分泌激素之间有着密切而复杂的关联。癫痫患者往往存在内分泌激素的异常，常见的症状包括生育障碍、多囊卵巢、过早绝经及性功能障碍等。癫痫患者机体内激素（包括内源性或外源性激素）水平的波动，不仅可以直接影响癫痫发作频率和严重程度，而且还可以间接通过药物代谢动力作用改变抗癫痫药物的浓度，从而对癫痫的发作产生影响。研究显示，癫痫发作可能会导致机体的糖皮质激素（例如皮质醇）浓度升高，而过高水平的糖皮质激素会对“下丘脑
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垂体
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肾上腺（HPA）轴”的负反馈抑制增强，通过对认知的影响（例如注意分散、高度警觉、激发恐惧等）影响癫痫的发展。此外，癫痫发作和发作间歇的痫样放电还可能导致雌激素和孕激素的失调。还有研究表明，过高水平的糖皮质激素容易增加神经元兴奋性、痫性活动和癫痫易感性；过高水平的雌激素（例如雌二醇和雌酮）具有促痫作用，而孕激素可能具有抗癫痫作用。据报道，顽固性癫痫患者在癫痫发作间期的基线褪黑素水平较低，而发作后期的褪黑素水平升高，因此，监测癫痫患者的褪黑素水平，可能实现对癫痫发作的预测。
[0004]综上，癫痫与内分泌激素之间的关系复杂，监测癫痫患者的体内激素水平，有助于揭示癫痫患者的发作规律以及诱发癫痫和内分泌紊乱的病因机制和危险因素，这对癫痫患者的临床诊疗和生活质量的提高具有重大意义。
[0005]除癫痫外，激素及激素代谢组学在临床上的应用还有助于其他疾病的初步筛查和诊断，包括库欣综合征、醛固酮增多症、先天性肾上腺增生、性发育障碍和多囊卵巢综合征等。举例来说，欧洲肾上腺肿瘤研究网络建议对疑似肾上腺皮质癌的患者进行术前激素检查，特别推荐评估基础皮质醇、硫酸脱氢表雄酮、雄烯二酮、17α
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羟孕酮、睾酮、雄烯二酮和雌二醇等激素。此外，对疑似库欣综合征的患者进行皮质醇分泌的昼夜节律检查被认为是有意义的初步筛查。
[0006]综上所述，激素的准确定量对众多疾病的初步筛查、诊断和病程监测至关重要。由于具有相同的母体结构，类固醇激素的结构相似，检测难度较高。传统的检测方法为免疫测定法，但由于交叉反应，其难以同时测定多种结构类似的类固醇激素。气相色谱
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质谱法和气相色谱
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质谱/质谱法的出现虽然提高了定量限、信噪比和线性范围，但是其前处理极为
复杂，包括需要酶解去偶联、衍生化、固相萃取或液液萃取等，使用成本及时间成本极高，不利于临床上的大通量检测和自动化发展需求。在衍生化前处理方案中，整体前处理步骤包括：加入萃取剂
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震荡
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离心
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转移
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浓缩
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加入衍生化试剂
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震荡反应
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（加入萃取剂
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震荡
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离心
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转移
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浓缩
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）复溶。换句话说，衍生化前处理方案需要加入衍生化试剂来与待测的分析物进行化学反应。有些衍生化前处理方案甚至还会增加一步萃取
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浓缩步骤，以防止衍生化时加入的催化剂污染质谱。衍生化前处理方案中繁琐的步骤会增加检测人员的操作难度，使误差更容易被引入。同时，衍生化试剂需要在配制完成后及时使用，否则会部分失活导致衍生化效率下降甚至影响分析物的定量。例如，专利CN111366671B公开了一种同时检测血清中18种类固醇激素的化学衍生
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超高效液相色谱
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串联质谱法，其采用液液萃取
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化学衍生的前处理方法来提取目标类固醇激素，不仅前处理耗时较长（至少50 min），而且步骤繁琐（例如，加入萃取剂
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震荡
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离心
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转移
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浓缩
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加入衍生化试剂
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震荡反应
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复溶），极易引入误差。该方法使用成本及时间成本极高，而且对检测人员提出了更高的要求，这不仅违背大通量检测和自动化发展需求，而且难以推广至各级医疗机构。由于待测的分析物中有大极性物质及小极性物质，固相萃取方案无法对每一种分析物达到较为优异的回收率。同时，固相萃取方案也存在步骤繁琐的缺点。步骤繁琐不仅使得整体方法耗时长，而且每一步操作的准确性都会受检测人员个人能力和经验的影响，同一份样品甚至可能因为实际检测人员的不同而产生不同的结果。例如，专利CN112051348B公开了一种血清或血浆中类固醇激素的固相萃取方法，其前处理步骤更为繁琐（例如，加入甲醇沉淀蛋白
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调整有机相与水相的体积比
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离心
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对固相萃取板孔进行活化处理
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淋洗液处理
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洗脱液处理
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收集洗脱液处理后的馏分
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向收集板孔内加入水
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涡旋混匀
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封膜），仅离心步骤就需要5
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15 min，且极易引入误差。类似地，该方法使用成本及时间成本极高，而且对检测人员提出了更高的要求，这不仅违背大通量检测和自动化发展需求，而且难以推广至各级医疗机构。专利CN114674961A公开了一种非衍生化同步检测血清中17种类固醇激素的试剂盒，该专利的技术方案完全不涉及雌酮、雌二醇、雌三醇这三种雌激素的检测，其临床意义大打折扣。换句话说，目前的激素（特别是类固醇激素）检测方法中的前处理方法存在步骤繁琐、效率低等问题，难以推广至各级医疗机构且无法实现大通量和自动化检测。
[0007]除此之外，现有技术的部分检测方法还可能存在可重复性差的问题，进而影响检测结果的真实性和准确性。例如，在使用质谱仪Xevo TQ
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S并以5 μl为进样体积（样品仅浓缩了不到2倍）的条件下，一旦基线噪音增大、复杂生物基质中样品干扰因素增多、基质效应明显，专利CN111398447B的检测结果极易受到影响，进而可能无法实现其所公开的雌二醇的定量下限，这严重影响检测结果的真实性和准确性，也不利于推广应用。部分现有技术公开了以600 ℃作为离子源温度，这实际上会造成部分激素的降解，进而严重影响检测结果的真实性和准确性。

技术实现思路

[0008]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测血清样本中16种激素浓度的方法，所述激素包括17α
‑
羟孕酮、皮质醇、双氢睾酮、孕烯醇酮、孕酮、11
‑
脱氧皮质醇、21
‑
脱氧皮质醇、雄烯二酮、褪黑素、睾酮、皮质酮、脱氢表雄酮、雌三醇、雌酮、硫酸脱氢表雄酮和雌二醇，其特征在于，所述方法包括：S1 采用稳定同位素内标定量法，以所述激素的标准品与所述激素的内标物的浓度比为X轴，以所述激素的标准品与所述激素的内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线；S2 将待进样样本通过超高效液相色谱串联质谱进行检测，所述色谱的条件包括：流动相A为包含5 mM甲酸铵、乙酸铵、氟化铵、甲酸、乙酸、氢氟酸和氨水中的一种或两种的水溶液、流动相B为乙腈进行梯度洗脱；所述待进样样本为经前处理的所述血清样本，所述前处理方式包括利用包含所述内标物的萃取剂前处理所述血清样本后复溶，得到所述待进样样本；所述萃取剂包括乙酸乙酯和甲酸；所述质谱的条件包括：基于大气压力化学电离源，采用正负离子切换的检测模式和多反应监测的扫描模式，以及2周期3实验模式，其中所述2周期3实验模式包括：周期1实验1：气帘气为35 psi，放电电流为4 μA，离子化电压为5500 V，温度为450 ℃，喷雾气为60 psi；周期1实验2：气帘气为35 psi，放电电流为4 μA，离子化电压为
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4500 V，温度为450 ℃，喷雾气为60 psi；和周期2实验1：气帘气为35 psi，放电电流为4 μA，离子化电压为5500 V，温度为550 ℃，喷雾气为60 psi；S3 利用所述校准曲线，计算并获得所述血清样本中的所述激素的浓度。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述17α
‑
羟孕酮、所述皮质酮、所述双氢睾酮、所述孕烯醇酮、所述孕酮、所述11
‑
脱氧皮质醇、所述21
‑
脱氧皮质醇、所述雄烯二酮、所述褪黑素、所述睾酮、所述皮质醇和所述脱氢表雄酮采用正离子模式，对应的碰撞电压分别为40 V、33 V、24 V、34 V、27 V、33 V、25 V、30 V、20 V、31 V、80 V和18 V；所述雌三醇、所述雌酮、所述硫酸脱氢表雄酮和所述雌二醇采用负离子模式，对应的碰撞电压分别为
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51 V、
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50 V、
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30 V和
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50 V。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标物包括d9
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孕酮、d5
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睾酮和d4
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雌二醇。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述前处理方式具体包括：向200 μL所述血清样本中加入2 mL所述包含所述内标物的萃取剂，涡旋1min后以3000 r/min离心1 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈蕾，王振磊，邸相杰，赖婉琳，张梦雨，金瑛，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：