膦酸盐产品和方法技术

本文中发明专利技术人表明菠萝泛菌(P.ananatis)产生至少三种膦酸盐，其中两种被纯化并进行了结构表征。第一种，命名为潘塔磷(pantaphos)，被证明为2

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】膦酸盐产品和方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2021年4月29日提交的美国临时专利申请63/181,745以及2020年9月5日提交的美国临时专利申请63/075,138的优先权，且上述在先申请在此通过引用纳入本文。
[0003]政府资助
[0004]本专利技术是在美国政府支助下由National Institutes of Health提供的拨款R01 GM127659的资助进行的。美国政府对本专利技术享有某些权利。

技术介绍

[0005]泛菌(Pantoea)物种自1928年以来被认为是植物病原体。这些革兰氏阴性肠杆菌起初被归为欧文氏菌属的成员，但随后根据DNA杂交实验被转到泛菌属。尽管许多Pantoea物种是良性或有益的植物共生体，但菠萝泛菌(P.ananatis)菌株总是与有害作物和森林虫害相关。自1983年，在11个国家中，已知P.ananatis的宿主已增加到8种植物，包括水稻，玉米，洋葱，甜瓜和菠萝等重要作物。一旦植物感染，这些细菌会导致内部腐烂，死亡和枯萎病，从而造成严重的经济损失。除了田间的主要感染外，还报告了洋葱心腐病的严重收获后损失。此外，这种植物病原体还可以感染人类和昆虫，其作为植物感染的媒介。因此，迫切需要了解P.ananatis的发病机制，以帮助解决其在主要粮食作物中的流行问题。
[0006]尽管P.ananatis感染对经济和食品安全有影响，但植物致病性的机制最近才被研究。比较基因组分析揭示了P.ananatis菌株之间的显著差异，这可能解释了它们在如此多不同宿主中定植和旺盛生长的能力。不同的P.ananatis基因组编码的致病性决定因素包括群体感应系统，VI型分泌系统，运动因子，细胞壁降解酶和硫代亚硫酸酯抗性等位基因。最近，通过比较两种致病性和两种非致病性P.ananatis菌株的基因组序列，揭示了洋葱心腐病的新致病性决定因素(Mol Plant Microbe Interact 2018,31:1291)。
[0007]所述方法鉴定了名为“HiVir”的基因组岛，其随后经由基于PCR的筛选显示在14个致病菌株中存在，而在16个非致病菌株中不存在。HiVir基因座编码11个基因操纵子(以下称为hvr)，其被建议，基于假定的pepM基因的存在，编码未知膦酸天然产物的生物合成途径。该基因编码膦酸烯醇式丙酮酸(PEP)膦酰化酶，其催化所有表征的膦酸盐生物合成途径的第一步，并被广泛用作生产膦酸代谢物能力的遗传标记。在P.ananatis OC5a中pepM的缺失导致Allium cepa(洋葱)中致病性严重减弱，证明了hvr操纵子在洋葱心腐病中所需的作用。基于这一发现，Asselin等人认为小分子膦酸盐参与了由P.ananatis引起的植物病害。
[0008]膦酸盐(Phosphonates)，由化学稳定的碳磷键的存在而定义，是一类不发达的生物活性分子，在医药和农业中都有重要应用。这些分子的生物活性源于它们与磷酸酯(phosphate esters)和羧酸(carboxylic acids)的结构相似性，这使得它们能够结合作用于类似底物的酶，从而抑制酶活性。一个突出的例子是人造除草剂草甘膦，它在20世纪50年代首次由化学家合成。草甘膦的植物毒性是由于其抑制5
‑
烯醇丙酮酸莽草酸
‑3‑
磷酸(EPSP)合成酶，这是植物中芳香族氨基酸生物合成的关键酶。值得注意的是，单个膦酸盐的
酶抑制是非常特殊的，通常仅限于作用于化学同源底物的酶。因此，膦酸盐可能对一组生物有毒，而对另一组生物无害。因此，取决于发现目标酶的生物体，膦酸盐可作为特定的抗菌，抗真菌，抗寄生虫和除草化合物应用。鉴于磷酸酯和羧酸在代谢中的普遍存在，膦酸盐抑制剂的潜在生物靶点范围很广。事实上，正如已知的生产生物活性膦酸盐的生物数量所证明的那样，自然界经常利用这种代谢的致命弱点。实例包括由链霉菌属成员生产的磷丝菌素三肽(phosphinothricin tripeptide)和磷霉素(fosmidomycin)，它们由于分别抑制必需酶的谷氨酸合酶和脱氧木酮糖
‑5‑
磷酸还原酶而具有强大的除草和抗菌活性。自然也利用了C
‑
P键高度稳定且抗化学和酶降解的事实。因此，许多生物用类似的磷酸酯取代不稳定的生物分子，如磷脂和磷酸酯修饰的胞外多糖。
[0009]考虑到它们有用的生物性质，膦酸盐化合物的生物合成在微生物中很常见也就不足为奇了。基于测序基因组和元基因组中pepM的存在，约5％的细菌具有膦酸盐生物合成能力。已知包括pepM的生物合成基因簇可指导磷脂，磷聚糖和多种小分子次级代谢产物的生物合成。与上述链霉素衍生的天然产物一样，许多小分子磷酸酯具有生物活性。尽管在理解小分子膦酸酯的生物活性和生物合成方面取得了相当大的进展，但只有一部分观察到的编码pepM的基因簇被表征。因此，自然界中膦酸盐化学多样性的程度尚未确定。
[0010]与膦酸盐生物合成在自然界中很常见的观点一致，也观察到约30％的测序细菌基因组含有膦酸盐分解代谢的基因，这允许它们用作磷，碳或氮的来源。编码碳磷(C
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P)裂解酶系统的基因在细菌中特别常见，该系统催化具有广泛底物特异性的多步膦酸盐降解途径。其他例子包括对氨基乙基膦酸酯具有特异性的酶膦酸酯，以及最近表征的使用羟甲基膦酸酯的氧化途径。
[0011]农业面临的挑战之一是对合成除草剂的出现的耐药性，以及缺乏新的，有效的天然产品除草剂。据估计，只有7％的传统害虫防治剂(包括杀虫剂，杀菌剂和除草剂)是天然产物或天然产物。然而，就除草化合物而言，自1997年以来，只有一类天然产物衍生的除草剂被注册，与30％的杀菌剂和杀虫剂相比，只有8％的除草化合物是天然产物衍生。由该菌株生产的这种天然产物的衍生物可以作为抗除草剂作物的替代有机处理策略。
[0012]存在的问题是，对商用除草剂的耐药性增加对农业造成了威胁。因此，需要开发新型除草剂来对抗这种耐药性。

技术实现思路

[0013]菠萝泛菌(Pantoea ananatis)是一种重要的植物病原体，针对许多重要的作物，由于缺乏有效的治疗方法来防止其传播，这一问题变得更加复杂。我们确定潘塔磷(pantaphos)是洋葱心腐病的关键毒力因子，这表明可以采用多种方法来解决这一重要的植物疾病。此外，该分子的一般植物毒性表明，它可以被开发成一种有效的除草剂，以对抗抗除草剂杂草的惊人增长。
[0014]因此，本公开提供了一种组合物，其包含式I的化合物:
[0015][0016]或其盐；其中：
[0017]表示单键或双键；
[0018]表示双键或单键，其中和不都是双键；
[0019]G是X
A
CHOR5,O,C(＝O),C(＝CH2),CHP(＝O)(R6)2或CX
B2
；
[0020]X
A
是缺位或O；
[0021]每个X
B
各自独立的为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，其包含式I的化合物:或其盐；其中：
‑‑‑‑‑
表示单键或双键；表示双键或单键，其中和
‑‑‑‑‑
不都是双键；G为X
A
CHOR5,O,C(＝O),C(＝CH2),CHP(＝O)(R6)2或CX
B2
；X
A
为缺位或O；每个X
B
各自独立的为H或卤素；R1和R2各自独立的为OR
A
或氨基酸；R3为
–
C(＝O)R7或三唑或四唑；R4为
–
C(＝O)R8或三唑或四唑；R5为H,
–
(C1‑
C6)烷基，
–
(C3‑
C6)环烷基，芳基或杂芳基；每个R6各自独立的为OR
B
或氨基酸；R7和R8各自独立的为OR
C
或氨基酸；以及R
A
，R
B
和R
C
各自独立的为H，
–
(C1‑
C6)烷基，
–
(C3‑
C6)环烷基，芳基或杂芳基；以及非水性流体，添加剂或其组合。2.根据权利要求1所述的组合物，其中G为CHOR5。3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述化合物为(S)
‑
对映体。4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述化合物为(R)
‑
对映体。5.根据权利要求1所述的组合，其中R1和R2为OR
A
。6.根据权利要求1所述的组合物，其中R3和R4为
‑
CO2R
C
。7.根据权利要求6所述的组合物，其中R3和R4当为双键时具有顺式构型。8.根据权利要求1所述的组合，其中式I的化合物可表示为式II:或其盐。9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述化合物为pantaphos:10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述化合物为化合物2:
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组合物进一步包括pantaphos。12.一种具有式I的化合物:或其盐；其中：
‑‑‑‑‑
表示单键或双键；表示双键或单键，其中和
‑‑‑‑‑
不都是双键；G为X
A
CHOR5,O,C(＝O),C(＝CH2),CHP(＝O)(R6)2或CX
B2
；X
A
为缺位或O；每个X
B
各自独立的为H或卤素；R1和R2各自独立的为OR
A
或氨基酸；R3为
–
C(＝O)R7或三唑或四唑；R4为
–
C(＝O)R8或三唑或四唑；R5为H,
–
(C1‑
C6)烷基，
–
(C3‑
C6)环烷基，芳基或杂芳基；每个R6各自独立的为OR
B
或氨基酸；R7和R8各自独立的为OR
C
或氨基酸；以及R
A
，R
B
和R
C
各自独立的为H，
–
(C1‑
C6)烷基，
–
(C3‑
C6)环烷基，芳基或杂芳基；其中所述化合物不是天然产物。13.根据权利要求12所述的化合物，其中所述化合物不是2
‑
(羟基(膦酰基)甲基)马来酸或2
‑
(膦酰基甲基)马来酸。14.根据权利要求12所述的化合物，其中G为CHOH。15.根据权利要求12所述的化合物，其中R1和R2为OH。16.根据权利要求12所述的化合物，其中R3和R4为
‑
CO2H。17.一种抑制杂草生长或生成的方法，包括使所述杂草和/或可生成杂草的土壤，以及权利要求1
‑
16任一项所述的除草有效量的组合物或化合物，其中所述杂草的生长或生成被抑制。18.根据权利要求17所述的方法，其中使所述组合物或化合物接触植被和/或可以生成植被的土壤，并且所述杂草的生长或生成被选择性地抑制。19.一种抑制癌细胞发展的方法，包括使癌细胞和权利要求1
‑
16任一项所述的有效量的组合物或化合物，其中癌症的发展被抑制。20.根据权利要求19所述的方法，其中癌细胞是胶质母细胞瘤细胞。21.一种形成2
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(羟基(膦酰基)甲基)马来酸的方法:
或其盐，包括:a)将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)异构化成3
‑
磷酸丙酮酸(PnPy)；b)将乙酰基与PnPy缩合形成膦酰基甲基苹果酸盐(PMM)；c)将PMM脱水成2
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膦酰基甲基马来酸盐；以及d)将2
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膦酰基甲基马来酸盐氧化成pantaphos；其中各个步骤a)
‑
d)都是在容器中完成。22.根据权利要求21所述的方法，其中异构化是由PEP突变酶(HvrA)催化；缩合作用是由膦酰基甲基苹果酸盐合成酶(HvrC)催化，乙酰基为乙酰辅酶A；脱水作用是由大异丙基苹果酸脱水酶(HvrD)和/或小异丙基苹果酸脱水酶(HvrE)催化；以及氧化作用是由黄素依赖性单加氧酶(HvrB)和可选的黄素还原酶(HvrK)催化。23.一种核酸分子，包括Pantoea Sp.的hvr操纵子和任选的可操作性连接到hvr操纵子的诱导型启动子。24.根据权利要求23所述的核酸分子，其包含选自hvrA,...

【专利技术属性】
技术研发人员：‑，
申请(专利权)人：伊利诺伊大学董事会，
类型：发明
国别省市：