山药Dioscorin蛋白的特征肽段在鉴别山药产品真实性方面的应用制造技术

本发明专利技术涉及山药Dioscorin蛋白的特征肽段在鉴别山药产品真实性方面的应用，属于食品检测领域，所述特征肽段的序列为：QAVNENAMNNA。所述应用方法为检测样品中是否含有所述的特征肽段；若含有所述特征肽段，则判定所述样品中含有山药；若不含有所述特征肽段，则判定所述样品中不含有山药。本发明专利技术提供的山药Dioscorin蛋白含量的检测方法具有特异性强，能够从木薯、毛芋、马铃薯、玉米蛋白的中区分出山药Dioscorin蛋白。山药Dioscorin蛋白。山药Dioscorin蛋白。

【技术实现步骤摘要】
山药Dioscorin蛋白的特征肽段在鉴别山药产品真实性方面的应用


[0001]本专利技术属于分子生物学或食品检测领域，具体涉及一种山药Dioscorin蛋白的特征肽段在鉴别山药产品真实性方面的应用。

技术介绍

[0002]山药，又名淮山，通称薯蓣，是粮、菜、药兼用的作物，在我国河南、河北、东北三省等地广泛种植。山药的加工使山药作为食品或原料得以更好的利用，并可以解决淡季可用性的问题。随着生活质量水平的提高，人们也越来越注重健康，市面上也不断出现许多含有山药的产品。但是有些不法生产商为了减少成本，使用木薯等来替代山药产品，侵犯了消费者权益。

技术实现思路

[0003]针对上述技术问题，通过研究发现，山药中蛋白质含量占干重的1％
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3％，其中Dioscorin蛋白占块茎可溶性蛋白总量的80％
‑
85％，本专利技术提供一种山药Dioscorin蛋白的特征肽段在鉴别山药产品真实性方面的应用。
[0004]本专利技术是通过如下技术方案来实现的：
[0005]山药Dioscorin蛋白的特征肽段在鉴别山药产品真实性方面的应用，所述特征肽段的序列为：QAVNENAMNNA。
[0006]本专利技术还提供一种鉴别山药产品的方法，该方法包括：检测山药产品中是否含有所述的特征肽段；若含有所述特征肽段，则判定所述山药产品中含有山药；若不含有所述特征肽段，则判定所述山药产品中不含有山药。
[0007]作为优选，采用液相色谱串联质谱进行所述检测，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z587.25129的质荷比；子离子包含质荷比为m/z762.29610和m/z1046.44456的子离子，其允许偏差在5ppm以内。
[0008]作为优选，采用同位素内标法对山药Dioscorin蛋白进行定量检测，其中所使用的内标肽段为：QAVNENAMNNA*；所述内标肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子为m/z592.25543；子离子包含质荷比为m/z771.93472和m/z1056.74556的子离子，其允许偏差在5ppm以内；
[0009]进一步，根据特征肽段/稳定同位素内标肽段峰面积比带入公式求得特征肽段浓度，再根据式1得到特征肽段QAVNENAMNNA的含量。
[0010]X＝(Ф*c*V)/m 式1；
[0011]其中，X为(ng/g)是山药样品中特征肽段QAVNENAMNNA的含量，Ф是酶解蛋白体积占总样品体积比例，c(ng/mL)是特征肽段在胰蛋白酶消化物中的浓度，V(mL)是胰蛋白酶消化物的体积，m(g)是山药样品的质量。
[0012]样品中只有在精确m/z值和特征碎片离子方面同时满足以上的特异性，方可肯定
所求的该样品中的Dioscorin蛋白含量可信，根据此含量的高低鉴别样品质量。
[0013]作为优选，所述样品的前处理包括：对待测样品中的蛋白进行提取，采用胰蛋白酶对所述蛋白进行酶解。
[0014]作为优选，采用UHPLC
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Q Exactive plus或三重四级杆质谱进行液相色谱串联质谱检测。
[0015]基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本专利技术保护范围。
[0016]本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术利用山药Dioscorin蛋白的特征肽段鉴别山药产品真实性，根据待测样品中山药Dioscorin蛋白的特征肽段的含量，进而获得山药蛋白的含量，从而进一步推算出样品中山药蛋白的比例。本专利技术提供的山药Dioscorin蛋白含量的检测方法特异性强，对消费者合理选择山药产品提供了方法支撑，保护了消费者权益。
附图说明
[0017]图1为山药样品中特征肽段的离子流图；
[0018]图2为山药样品特征肽段的质谱图；
[0019]图3为山药样品特征肽段的二级碎片质谱图；
[0020]图4为山药样品内标(IS)肽段的离子流图；
[0021]图5为山药样品内标(IS)肽段的质谱图；
[0022]图6为山药样品内标(IS)肽段的二级碎片质谱图。
具体实施方式
[0023]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0024]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025]亚硫酸氢钠、盐酸、氢氧化钠、碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAA)、二硫苏糖醇(DL
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Dithiothreitol，DTT)、NH4HCO3、质谱级胰蛋白酶、甲酸、乙腈、PBS溶液
[0026]溶液配制：40mM NH4HCO3溶液：称取0.316gNH4HCO3，用超纯水定容100mL，4℃冰箱保存待用。
[0027]100mM DTT溶液：称取DTT 0.308g，用40mM NH4HCO3溶液溶解、混匀并定容至20mL，
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20℃冰箱保存待用。
[0028]100mM IAA溶液：称取IAA 0.39g，用40mM的NH4HCO3溶液定溶至20mL，
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20℃冰箱保存待用。
[0029]仪器：超高效液相色谱串联四极杆/高分辨静电轨道阱质谱仪(UHPLC
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QExactive Plus)、高速离心机、磁力搅拌器、pH计、匀浆机、涡旋混合器。
[0030]实施例1山药Dioscorin蛋白特征肽段的发掘。
[0031]第一步、选取完整的山药，进行清洗、去皮、切块后，加入一定体积含1％亚硫酸氢钠冰水抽提溶液进行匀浆，得到的浆液低速搅拌一定时间后进行离心(6500r/min，35min)，使用2mol/L盐酸或2mol/L氢氧化钠溶液将所得上清液(蛋白提取液)的pH值调至等电点3.5
进行酸沉，磁力搅拌1.2h后，离心，得到的沉淀加水回溶并调节pH到7.0，经过超滤后，旋转蒸发干燥后即可得到山药Dioscorin蛋白粉。
[0032]第二步、使用高压灭菌锅，127℃条件下处理第一步得到的山药蛋白粉，使其失去胰蛋白酶抑制剂活性，待恢复至室温后，取山药蛋白粉按1:1比例加入PBS溶液，充分涡旋后4℃条件下离心20min，收集上清液；取50μL上清液，加入200μL 40mM的NH4HCO3溶液与之涡匀混合，加入25μL 100mM的DTT溶液，充分涡旋混匀后，室温条件下反应60min，再加入125μL 100mM的IAA溶液在室温条件暗反应60min。
[0033]第三步、向第二步的最终溶液加入2μg过量胰蛋白酶，37℃环境中过夜酶切。加入1μL甲酸溶液，终止酶切反应。将酶切产物与0.1％甲酸溶液按2:3体积比混合后，通过C18柱除盐，除盐后的样品采用真空干燥处理。
[0034]第四步、第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.山药Dioscorin蛋白的特征肽段在鉴别山药产品真实性方面的应用，其特征在于，所述特征肽段的序列为：QAVNENAMNNA。2.根据权利要求1所述的山药Dioscorin蛋白的特征肽段在鉴别山药产品真实性方面的应用，其特征在于，所述应用的方法为检测样品中是否含有所述的特征肽段；若含有所述特征肽段，则判定所述样品中含有山药；若不含有所述特征肽段，则判定所述样品中不含有山药。3.根据权利要求2所述的山药Dioscorin蛋白的特征肽段在鉴别山药产品真实性方面的应用，其特征在于，样品的前处理包括：对待测样品中的蛋白进行提取，采用胰蛋白酶对所述蛋白进行酶解。4.根据权利要求2所述的山药Dioscorin蛋白的特征肽段在鉴别山药产品真实性方面的应用，其特征在于，采用液相色谱串联质谱进行所述检测，所述特征肽段在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z587.25129的质荷比；子离子包含质荷比为m/z762.29610和m/z1046.44456的子离子，其允许偏差在5ppm以内。5.根据权利要求3所述的山药Dioscorin蛋白的特征肽段在鉴别山药产品真实性...

【专利技术属性】
技术研发人员：李彦伸，傅怡，李启燕，张玉顺，刘慧慧，毛馨，郝倩，尤艳莉，
申请(专利权)人：烟台大学，
类型：发明
国别省市：