一种用于检测Tg737基因的LAMP引物组和方法技术

本发明专利技术提供了一种用于检测Tg737基因的LAMP引物组和方法，根据Tg737基因设计一组环介导等温扩增引物(SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测Tg737基因的LAMP引物组和方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，具体涉及一种用于检测Tg737基因的LAMP引物组和方法。

技术介绍

[0002]慢加急性肝衰竭（acute
‑
on
‑
chronic liver failure，ACLF）致病机理复杂、病死率高，是在慢性肝病基础上出现的急性肝功能失代偿。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC），具有在体外多向分化、增殖、低免疫原性的特点，作为有效的治疗手段应用于ACLF。通过一定手段来监测，则可对其治疗的疗效、临床实用价值等进行评估。Tg737基因在藻类中发现位于13号染色体q12.11是一蛋白质编码基因，编码的极性蛋白与选择性自噬、软骨内成骨与细胞驱动有关，与色素性视网膜炎和多囊肾病疾病相关。研究发现Tg737基因与细胞增殖与凋亡、低氧条件下的转移与侵袭相关，ACLF 的重要病理过程是肝细胞受损，干细胞治疗ACLF 过程中，Tg737 基因表达是呈升高趋势。
[0003]自Kary Mullis专利技术了PCR技术以来，随着酶工业的发展，基于恒温扩增的等温扩增（isothermal amplification technology，ITA）核酸检测技术以依赖核酸序列的扩增（nucleic acid sequence
‑
based amplification，NASBA)、环介导等温扩增（loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物扩增（crossing primingamplification，CPA）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA)、重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA)、滚环扩增（rolling circleamplification，RCA)和依赖解旋酶的扩增（helicase
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dependent amplification，HDA)等多种形式广泛应用于农业、医疗等领域。侧流免疫层析分析（lateralflow immunochromatography assay，LFIA）是一种基于抗原、抗体免疫反应的经典快速检测技术，结合两者之优点，LAMP
‑
LFIA核酸检测技术在可视化基础上增强敏感度。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种用于检测Tg737基因的LAMP引物组和方法，是一种基于LAMP
‑
侧流免疫层析技术生物传感检测方法。
[0005]本专利技术构思如下：开发一种Tg737基因快速且敏感发检测方法。建立基于环介导等温扩增反应(LAMP)和侧流免疫层析分析生物传感器。在LAMP反应中，使用荧光素(FAM)修饰的和生物素(Bio)修饰的引物，检测Tg737基因。标记颗粒（金颗粒、乳胶颗粒或荧光颗粒）的免疫层析试纸条放大检测信号，通过目视或相应阅读仪进行结果判断、判读或定量，为简易便利检测Tg737基因提供有效方法，应用于评估ACLF接受干细胞移植治疗评估疗效判断。
[0006]为了实现本专利技术目的，本专利技术提供用于检测Tg737的LAMP引物组，包括反向外引物B3、正向外引物F3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB；各引物序列如SEQ ID No.1
‑
6所示：B3：5
’‑
AAATGCAGAGCCTCTCAA
‑3’
；
F3：5
’‑
AGACCTCCAATAACTGCTAA
‑3’
；FIP：5
’‑
TCCTATTGATGATGCCAGAGATGTCCACGGCAGTTACTAGACCTA
‑3’
；BIP：5
’‑
GACAGGGGCTATTCAGGATGGTGCTTTGGTAAAACCAGCT
‑3’
；LF：5
’‑
TTGGACCCATATCCAGTAGC
‑3’
；LB：5
’‑
AGTTACTAGACCCATGACAGC
‑3’
；其中，引物FIP的5
’
端标记荧光素FAM，引物BIP的5
’
端标记生物素Biotin。
[0007]本专利技术基于LAMP
‑
侧流免疫层析技术检测Tg737基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）提取待测样品的RNA并逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，利用权利要求1所述LAMP引物组进行LAMP
‑
PCR扩增反应；LAMP
‑
PCR扩增反应的体系为：2μLFIP，2μLBIP，0.5μLF3，0.5μLB3，1.0μLLF，1.0μLLB；12.5μLLAMPmasterMix缓冲液，其中Mg
2+
浓度为6.0uM，dNTPMix10.0uM；1μL模板；0.5μLBstDNA聚合酶；0.5μL参比荧光染料ROX，0.25μL荧光染料100
×
EvaGreen，补足无菌水至25μL。LAMP
‑
PCR扩增反应条件为：65℃1min，共45个循环。
[0008]（2）取200倍稀释LAMP
‑
PCR扩增产物60
‑
80μL加到侧流免疫层析试纸条的检测孔内，静置5
‑
10分钟，通过目视进行结果判断，阴性反应：质控线显色，检测线不显色；阳性反应：质控线、检测线均显色；反应失效：质控线不显色，示检测失败或试纸条失效。
[0009]上述侧流免疫层析试纸条，有效结合了层析技术的分离能力和免疫分析的高度特异性，侧流免疫层析试纸条为金颗粒免疫层析试纸条，该试纸条包括标记颗粒的制备及免疫层析试纸条的组装。金颗粒免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤： 1)金颗粒的制备：洁净干燥三角烧瓶置磁力搅拌器上，将1mMHAuCl4溶液100mL加入烧瓶中，快速搅拌回流加热后，缓慢加入5mL80mM的C6H5Na3O7溶液在室温进行充分反应，溶液经由无色、浅黄色至红色，反应时间为15
‑
20分钟，反应完成后停止搅拌，溶液冷却后置于4℃保存。
[0010]2)免疫金颗粒的制备：
①
将金颗粒分别与鼠抗人IgG（0.5mg/mL）和生物素抗体（0.5mg/mL）作用。取上述5mL金纳米颗粒溶液，将其pH值调至弱碱性(pH=8.5)，然后加入生物素抗体10μL，之后再漩涡混合器上充分反应，2小时后，加1%BSA500μL封闭，室温下放置24小时。再10000rpm转速下离心30分钟，弃上清，沉淀重溶于1ml水溶液中，获得生物素抗体修饰的金颗粒。相同步骤处理鼠抗人IgG，获得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测Tg737基因的LAMP引物组，其特征在于：包括反向外引物B3、正向外引物F3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB；各引物序列具体如下：B3：5
’‑
AAATGCAGAGCCTCTCAA
‑3’
；F3：5
’‑
AGACCTCCAATAACTGCTAA
‑3’
；FIP：5
’‑
TCCTATTGATGATGCCAGAGATGTCCACGGCAGTTACTAGACCTA
‑3’
；BIP：5
’‑
GACAGGGGCTATTCAGGATGGTGCTTTGGTAAAACCAGCT
‑3’
；LF：5
’‑
TTGGACCCATATCCAGTAGC
‑3’
；LB：5
’‑
AGTTACTAGACCCATGACAGC
‑3’
；其中，引物FIP的5
’
端标记荧光素FAM，引物BIP的5
’
端标记生物素Biotin。2.一种基于LAMP
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侧流免疫层析技术检测Tg737基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）提取待测样品的RNA并逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，利用权利要求1所述LAMP引物组进行LAMP
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PCR扩增反应；（2）取LAMP
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PCR扩增产物进行200倍稀释后，取60
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80μL加到侧流免疫层析试纸条的检测孔内，静置5
‑
10分钟，通过目视进行结果判断，阴性反应：质控线显色，检测线不显色；阳性反应：质控线、检测线均显色；反应失效：质控线不显色，则检测失败或试纸条失效。3.根据权利要求1所述的基于LAMP
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侧流免疫层析技术检测Tg737基因的方法，其特征在于：LAMP
‑
PCR扩增反应的体系为：2μLFIP，2μLBIP，0.5μLF3，0.5μLB3，1.0μLLF，1.0μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡辉，陈小梅，张磊升，曲涛，马海忠，徐向红，
申请(专利权)人：甘肃省人民医院，
类型：发明
国别省市：