【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程抗体，具体涉及抗eno1的人鼠嵌合抗体和单链抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、宫颈癌是女性最常见的妇科恶性肿瘤之一。尽管hpv疫苗的引入降低了最常见的高危hpv血清型(hpv16和18)的发病率，但宫颈癌的发病率和死亡率仍然很高。目前，宫颈癌的治疗主要集中在早期外科手术治疗、放化疗及靶向药物治疗。对于晚期、复发转移及放化疗耐药的患者，治疗方案有限。因此，有必要进一步找到能够治疗宫颈癌的方法。近年来，免疫学的发展及抗体靶向治疗的提出为晚期患者带来了希望。抗体类药物在宫颈癌治疗中的应用已成为目前研究的主要方向之一。
2、代谢重编程是癌细胞的标志之一。癌细胞选择能量相对缺乏的有氧糖酵解途径(warburg效应)而不是节能氧化磷酸化途径的特殊倾向在肿瘤学中引起了广泛关注。在糖酵解这个过程中，许多关键代谢酶，如己糖激酶、果糖1，6-二磷酸磷酸果糖激酶和丙酮酸α-烯醇化酶(eno1)均被发现在癌细胞中过度表达或过度活化。其中，eno1在多数癌症类型中过度表达，eno1可将2-磷酸甘油酸脱水为磷酸烯醇丙酮酸，是糖酵解途径中的关键酶之一，占糖酵解途径中总细胞烯醇化酶活性的90％。eno1也可促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，从而导致各种肿瘤的加速进展。在这种情况下，参与肿瘤糖酵解的eno1酶是有希望的靶标，并可能为癌症治疗开辟全新的治疗机会。
3、单抗靶向抗肿瘤疗法已经成为一种抗肿瘤治疗的新途径。单克隆抗体是一类有前途的靶向抗癌剂，可增强天然免疫系统功能，抑制癌细胞活性并消除癌细胞。单克隆抗体药物
4、本课题组前期已通过杂交瘤技术制备eno1单克隆抗体。研究发现eno1单克隆抗体可抑制宫颈癌细胞的侵袭转移能力。但单克隆抗体在临床治疗中，鼠源性抗体应用于人体时会引起免疫反应，人体免疫系统可识别单克隆抗体的恒定区，产生诱发人抗鼠抗体反应的免疫副作用。因此，为了后期将抗eno1抗体应用于临床，鼠源性抗体的人源化改造是必要的。另外，促进糖酵的eno1主要位于细胞质内，eno1mab分子量较大，不能直接穿过细胞膜进入细胞质内，而单链抗体分子量小，可直接进入细胞内发挥抗eno1作用。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供本实验构建的eno1人鼠嵌合抗体真核载体，单链抗体原核表达载体及真核表达载体，通过在expi293ftm及bl21细胞中进行表达，获得特异性的eno1人鼠嵌合抗体及单链抗体，通过体外细胞实验评价嵌合抗体及单链抗体抗肿瘤细胞的作用。
2、鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供抗eno1的人鼠嵌合抗体及应用，并提供了编码该嵌合抗体的的核苷酸、载体和宿主细胞，本专利技术提供的抗eno1人鼠嵌合抗体轻链的三个cdr区分别具有如seq id no:2、3和4所示的核苷酸序列；重链的三个cdr区分别具有如seq id no:6、7和8所示的氨基酸序列。所述重链及轻链可变区分别与人重链的恒定区及人轻链恒定区嵌合，形成比现有的抗eno1单克隆抗体更加安全可靠的、功能更显著的抗eno1嵌合抗体，所述嵌合抗体具有高特异性地抗eno1的作用。
3、本专利技术还提供一种靶向eno1的单链抗体及应用，并提供了编码该单链抗体的的核苷酸、载体和宿主细胞，本专利技术提供的抗eno1单链抗体轻链的三个cdr区分别具有如seq idno:2、3和4所示的核苷酸序列；重链的三个cdr区分别具有如seq id no:6、7和8所示的氨基酸序列。靶向肿瘤的单链抗体(scfv)药物具有广阔的应用前景，scfv作为靶向分子具有以下优点：分子量小，穿透性较强，能实现人源化，易对其进行改造，可大规模生产等，目前国内外已有多种scfv药物并用于临床。
4、本专利技术提供一种抗eno1人鼠嵌合抗体，其特征在于：所述抗eno1人鼠嵌合抗体的抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；所述轻链可变区包含l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3，所述重链可变区包含h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3；
5、所述轻链可变区具有如seq id no:1所示的核苷酸序列，轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3具有如seq id no:2、3、4所示的核苷酸序列；所述重链可变区具有如
6、seq id no:5所示的核苷酸序列，重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3具有如
7、seq id no:6、7、8所示的核苷酸序列；
8、所述轻链可变区具有如seq id no:9所示的氨基酸序列，轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3具有如seq id no:10、11、12所示的氨基酸序列；所述重链可变区具有如seq id no:13所示的氨基酸序列，重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3具有如
9、seq id no:14、15、16所示的氨基酸序列。
10、优选的，本专利技术所述的一种抗eno1人鼠嵌合抗体中，还包括：恒定区，其轻链可变区与质粒ptrioz-higg1上的人kappa轻链(cl)嵌合；其重链可变区与质粒ptrioz-higg1上的人igg1重链恒定区(ch)嵌合，形成重组质粒vl-higg1-vh，可表达比现有eno1单克隆抗体更加安全可靠的抗eno1人鼠嵌合抗体，所述嵌合抗体能够高特异性地抗eno1的作用。
11、鉴于eno1可能参与宫颈癌的病理发生发展过程，本专利技术提供的抗eno1人鼠嵌合抗体还可应用于肿瘤的治疗。
12、本专利技术还提供了编码所述的嵌合抗体的核苷酸，具体的，编码seq id no:9所示氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列如seq id no:1所示；编码seq id no:13所示氨基酸序列的重链可变区的核酸序列如seq id no:5所示。
13、本专利技术提供一种靶向eno1的单链抗体，其特征在于：所述靶向eno1的单链抗体的抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；所述轻链可变区包含l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3，所述重链可变区包含h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3；
14、所述轻链cdr1、cdr2和cdr3具有如seq id no:2、3、4所示的核苷酸序列；所述重链cdr1、cdr2和cdr3具有如seq id no:6、7、8所示的核苷酸序列。
15、优选的，本专利技术所述的一种靶向eno1的单链抗体中，根据pcdna3.1(+)及上述可变区轻重链核苷酸序列设计含有ndei和hindiii酶切位点、带有6xhis以及终止密码的上游引物f和下游引物r，构建pcdna3.1-eno1单链抗体真核载体，重组质粒记为pcdna3-scfv。
16、优选的，本专利技术所述的一种靶向eno1的单链抗体中，所述轻链可变区和重链可变区通过linker连接，所述linker的核苷酸序列及氨基酸序列如seq id no：17本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗ENO1人鼠嵌合抗体，其特征在于：所述抗ENO1人鼠嵌合抗体的抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；所述轻链可变区包含L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，所述重链可变区包含H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3；
2.根据权利要求1所述的一种抗ENO1人鼠嵌合抗体，其特征在于：还包括恒定区，其轻链可变区与质粒pTRIOZ-hIgG1上的人Kappa轻链(CL)嵌合；其重链可变区与质粒pTRIOZ-hIgG1上的人IgG1重链恒定区(CH)嵌合，形成重组质粒VL-hIgG1-VH，可表达比现有ENO1单克隆抗体更加安全可靠的抗ENO1人鼠嵌合抗体，所述嵌合抗体能够高特异性地抗ENO1的作用。
3.根据权利要求2所述的一种抗ENO1人鼠嵌合抗体，其特征在于：提供了编码所述的嵌合抗体的核苷酸，具体的，编码SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；编码SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的重链可变区的核酸序列如SEQ IDNO:5所示。
4.一种靶向ENO1的单链抗体，其特征在于：所述
5.根据权利要求4所述的一种靶向ENO1的单链抗体，其特征在于：根据pcDNA3.1(+)及上述可变区轻重链核苷酸序列设计含有NdeI和HindIII酶切位点、带有6xHis以及终止密码的上游引物F和下游引物R，构建pcDNA3.1-ENO1单链抗体真核载体，重组质粒记为pcDNA3-scfv。
6.根据权利要求5所述的一种靶向ENO1的单链抗体，其特征在于：所述轻链可变区和重链可变区通过linker连接，所述linker的核苷酸序列及氨基酸序列如SEQ ID NO：17及SEQID NO：18所示或其功能性变体。
7.根据权利要求6所述的一种靶向ENO1的单链抗体，其特征在于：所述靶向ENO1的单链抗体具有如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列；所述靶向ENO1的单链抗体具有如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
8.一种表达载体，其特征在于，包括编码权利要求1所述的抗ENO1人鼠嵌合抗体的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的一种表达载体，其特征在于：其轻链可变区(VL)与质粒pTRIOZ-hIgG1上的人Kappa轻链(CL)嵌合形成VL-CL，具有如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列；其重链可变区(VH)与质粒pTRIOZ-hIgG1上的人IgG1重链恒定区(CH)嵌合形成VH-CH，具有如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。
10.一种原核表达载体PET-30a，其特征在于；所述表达载体包含权利要求4、6所述的核苷酸序列。
11.一种真核表达载体PCDNA3.1(+)，其特征在于：所述表达载体包含权利要求4、6所述的核苷酸序列。
12.转化权利要求8、10、11所述的表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞中包含权利要求8、10、11所述的表达载体，或所述宿主细胞的基因组上整合有外源的权利要求8、10、11所述的核苷酸序列。
13.转化力要求10所述的表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中包含权利要求10所述的表达载体，或所述宿主细胞的基因组上整合有外源的权利要求5、6所述的核苷酸序列。
14.权利要求1-3所述的抗ENO1单克隆嵌合抗体或权利要求4-7所述的单链抗体在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为宫颈癌。
...【技术特征摘要】
1.一种抗eno1人鼠嵌合抗体，其特征在于：所述抗eno1人鼠嵌合抗体的抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；所述轻链可变区包含l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3，所述重链可变区包含h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3；
2.根据权利要求1所述的一种抗eno1人鼠嵌合抗体，其特征在于：还包括恒定区，其轻链可变区与质粒ptrioz-higg1上的人kappa轻链(cl)嵌合；其重链可变区与质粒ptrioz-higg1上的人igg1重链恒定区(ch)嵌合，形成重组质粒vl-higg1-vh，可表达比现有eno1单克隆抗体更加安全可靠的抗eno1人鼠嵌合抗体，所述嵌合抗体能够高特异性地抗eno1的作用。
3.根据权利要求2所述的一种抗eno1人鼠嵌合抗体，其特征在于：提供了编码所述的嵌合抗体的核苷酸，具体的，编码seq id no:9所示氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列如seq id no:1所示；编码seq id no:13所示氨基酸序列的重链可变区的核酸序列如seq idno:5所示。
4.一种靶向eno1的单链抗体，其特征在于：所述靶向eno1的单链抗体的抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；所述轻链可变区包含l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3，所述重链可变区包含h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3；
5.根据权利要求4所述的一种靶向eno1的单链抗体，其特征在于：根据pcdna3.1(+)及上述可变区轻重链核苷酸序列设计含有ndei和hindiii酶切位点、带有6xhis以及终止密码的上游引物f和下游引物r，构建pcdna3.1-eno1单链抗体真核载体，重组质粒记为pcdna3-scfv。
6.根据权利要求5所述的一种靶向eno1的单链抗体，其特征在于：所述轻链可变区和重链可变区通...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘会玲，杨蕊，陈圆圆，祝秉东，李雯，章婷婷，代鹏钰，马昕芸，杨楠，刘小凤，
申请(专利权)人：甘肃省人民医院，
类型：发明
国别省市：
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