一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺制造技术

本发明专利技术涉及一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其包括如下步骤：S1菌株筛选：将构建的表达SOD的大肠杆菌BL21(DE3)进行摇瓶表达量筛选，得到的菌株进行高压发酵菌株筛选；S2种子活化：将S1筛选的菌株进行一级种子活化和二级种子活化；S3分批补料发酵：在灭菌后的基础培养基中接种S2获得的种子菌，进行分批发酵、一次补料发酵、诱导二次补料发酵获得，发明专利技术所提供的工艺，通过筛选、活化和发酵的条件设计，可以运用到了不同的表达菌株中，最终缩短的分批补料的发酵周期（17~19h），且提高了表达量（18~22g/L），最终比酶活可以达到20000U/mg。最终比酶活可以达到20000U/mg。

【技术实现步骤摘要】
一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺


[0001]本专利技术属于生物
，具体地，本专利技术涉及一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺。

技术介绍

[0002]超氧化物歧化酶，英文名为Superoxide Dismutase,简称：SOD。超氧化物歧化酶是自由基(O2
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)清除剂，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除自由基(O2
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)，而自由基(O2
‑
)具有细胞毒性，能使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症、肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老，因此在抗衰老、抗氧化、抗疲劳、调节体内自由基紊乱等方面均有应用。
[0003]目前，SOD的来源分别由动物提取、植物提取和微生物重组表达，动物提取存在一定的安全隐患，植物提取过程较为复杂且活性相对有限，微生物重组表达可以有效解决这两个问题，而且成本相对较低，过程简单且可控。现有的微生物表达多为部分基因替换修改后在再进行表达，例如CN112725295A公开了一种重组型超氧化物歧化酶(简称重组型SOD)及编码所述重组型SOD的基因和相关的表达载体、转基因细胞系和宿主菌，该重组型SOD经试验检验，具有极好的热稳定性、极好的酸碱耐受性和较好的常用防腐剂耐受性。CN111235121A涉及一种高稳定型的超氧化物歧化酶高效表达载体，还涉及上述的载体的构建以及应用，制备的载体所表达出来的蛋白稳定性高；工程菌表达产量大。而在不改变原始氨基酸排序的前提下，通过发酵工艺进行SOD的表达，其表达速度和酶活并不太理想。
[0004]有鉴于此，需要提供一种新的发酵工艺，在不改变原始氨基酸排序的前提下，即可获得理想表达速度和酶活性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，以提高SOD在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达和酶活性，缩短发酵周期，节约生产成本。
[0006]为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0007]本专利技术提供了一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其包括如下步骤：
[0008]S1菌株筛选：将构建的表达SOD的大肠杆菌BL21(DE3)进行摇瓶表达量筛选，得到的菌株进行高压发酵菌株筛选；
[0009]S2种子活化：将S1筛选的菌株进行一级种子活化和二级种子活化；
[0010]S3分批补料发酵：在灭菌后的基础培养基中接种S2获得的种子菌，进行分批发酵、一次补料发酵、诱导二次补料发酵获得。
[0011]作为本专利技术的一些优选实施方案，所述基础培养基的配方如下：
[0012][0013][0014]所述S3中一次补料发酵中所用的补料1的配方如下：
[0015]药品用量蛋白胨50～100g/L酵母粉50～100g/L葡萄糖50～100g/L甘油100～150g/L硫酸镁10～20g/L硫酸钠10～15g/L微量元素0.5～1.0mL/L
[0016]所述S3中二次补料发酵中所用的补料2的配方如下：
[0017]药品用量甘油200～300g/L硫酸铵20～30g/L硫酸铜10～20g/L硫酸钠10～15g/L微量元素0.5～1.0mL/L
[0018]作为本专利技术的一些优选实施方案，所述S3中分批发酵条件为：在灭菌后的基础培养基中以3～5％接种量接种，35～37℃，罐压0.05进行分批发酵，溶氧控制20％～40％。
[0019]作为本专利技术的一些优选实施方案，所述S3中一次补料发酵条件为：发酵4～6h待溶氧快速升高至60％时进行补料1补料，罐温35～37℃，罐压0.05～0.15Mpa进行补料发酵，溶氧控制30％～50％。
[0020]作为本专利技术的一些优选实施方案，所述S3中诱导二次补料发酵条件为；当补料发酵值OD600值为40～100时添加IPTG进行诱导发酵，罐温为25～28℃，罐压0.1～0.15Mpa，溶氧控制40％～60％，更换补料1为补料2。
[0021]作为本专利技术的一些优选实施方案，所述S1中摇瓶发酵为在180～220rpm，35～37℃于LB培养基中培养10～15h，接种于基础培养基的摇瓶中，培养2～6h后添加诱导剂进行诱导12～15h，筛选表达量高的菌株；所述高压发酵为将筛选的菌株接种到发酵罐中，控制罐压在0.05～0.15MPa之间，溶氧30％～60％之间，发酵4～6h，补加补料1，再发酵10h，得到菌株进行卡那抗性平板筛选。
[0022]作为本专利技术的一些优选实施方案，所述S2中种子活化为将
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80℃保藏的SOD的大肠杆菌接种于LB培养基中进行一级种子活化；一级种子活化条件为180～220rpm，35～37℃培养10～15h；活化后的一级种子进行二级活化，二级种子活化180～220rpm，35～37℃培养3
～5h。
[0023]作为本专利技术的一些优选实施方案，所述微量元素的配方如下：
[0024]药品用量(g/L)氯化铁0.6～0.8硫酸锰0.7～0.9硫酸镁1.9～2.1氯化钴0.03～0.05硫酸锌2.8～3.2硼酸0.09～0.11硫酸钙0.01～0.03硫酸铵9～11氯化铜1.4～1.6。
[0025]采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
[0026]本专利技术工艺将分批补料发酵分为三个阶段进行控制，对补料、溶氧、发酵温度、发酵压力进行了更为严格的控制精确的方法，特别是在诱导阶段采用25～28℃罐温、0.12～0.15Mpa罐压、40％～60％溶氧的工艺进行控制，并进行二次补料，获得了较高的表达量和比酶活。
[0027]本专利技术所提供的工艺，通过筛选、活化和发酵的条件设计，使得本工艺可以运用到了不同的表达菌株中，最终缩短的分批补料的发酵周期(17～19h)，且提高了表达量(18～22g/L)，最终比酶活可以达到20000U/mg。
[0028]本专利技术所提供的工艺，重复性高，工业应用性强，为SOD的规模性生产提供切实可靠的依据。
附图说明
[0029]构成本申请的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：
[0030]图1是本专利技术实施例1中的发酵过程控制图；
[0031]图2是本专利技术实施例1中的SDS
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PAGE电泳图；M表示蛋白Maker泳道，SOD1表示破菌后的蛋白泳道；
[0032]图3是本专利技术实施例2中的发酵过程控制图；
[0033]图4是本专利技术实施例2中的SDS
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PAGE电泳图；M表示蛋白Maker泳道，SOD2表示破菌后的蛋白泳道。
[0034]图5是本专利技术对比例1中的发酵过程控制图；
[0035]图6是本专利技术对比例1中的SDS
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PAGE电泳图；M表示蛋白Maker泳道，SOD2表示破菌后的蛋白泳道。
[0036]图7是本专利技术对比例2中的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其特征在于，其包括如下步骤：S1菌株筛选：将构建的表达SOD的大肠杆菌BL21(DE3)进行摇瓶表达量筛选，得到的菌株进行高压发酵菌株筛选；S2种子活化：将S1筛选的菌株进行一级种子活化和二级种子活化；S3分批补料发酵：在灭菌后的基础培养基中接种S2获得的种子菌，进行分批发酵、一次补料发酵、诱导二次补料发酵获得。2.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其特征在于，所述基础培养基的配方如下：所述S3中一次补料发酵中所用的补料1的配方如下：所述S3中二次补料发酵中所用的补料2的配方如下：3.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其特征在于，所述S3中分批发酵条件为：在灭菌后的基础培养基中以3～5％接种量接种，35～37℃，罐压0.05进行分批发酵，溶氧控制20％～40％。4.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其特征在于，所述S3中一次补料发酵条件为：发酵4～6h待溶氧快速升高至60％时进行补料1补料，罐温35～37℃，罐压0.05～0.15Mpa进行补料发酵，溶氧控制30％～50％。
5.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌生产SOD的发酵工艺，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐兰举，宋富，吴飞陶，于月欣，齐磊，
申请(专利权)人：河北纳科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：