一种增大大豆籽粒的方法技术

本发明专利技术提供了一种增大大豆籽粒的方法，所述方法通过利用Cas12i和gRNA对大豆miR396进行编辑，从而获得了籽粒增大、产量提高的大豆。产量提高的大豆。产量提高的大豆。

【技术实现步骤摘要】
一种增大大豆籽粒的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及在大豆中进行基因编辑的方法，尤其涉及一种利用Cas12i基因编辑技术获得的突变的miR396及其在增大大豆籽粒中的应用。

技术介绍

[0002]大豆是人类主要油脂和蛋白质的来源，是世界最重要的经济作物之一，也是人类植物油和植物性蛋白的主要来源。大豆因营养全面，蛋白含量高等诸多有点被广泛用于豆制品工和饲料。然而因为我国大豆产量低、农民种植经济效益低导致我国大豆种植面积小、总产量仅有2000万吨，80％以上的大豆依赖进口，严重威胁到国家粮食安全。
[0003]microRNA(miRNA)是一类非编码单链小RNA分子，它通过碱基配对结合靶基因的mRNA，从而调控靶基因。在植物的生长过程中，植物miRNA在调控分生组织特性、叶片极性和开花模式等方面发挥着关键性的作用。其中，植物miR396是一类高度保守的内源性的含有20
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24个核苷酸长度的非编码单链小RNA分子，能够调控其靶基因GRF的表达。相关研究表明，miR396能够调控作物的分蘖、粒型和穗型等，进而影响作物的产量。
[0004]CRISPR/Cas基因编辑技术用于作物育种具有不含转基因成分、育种周期短和定向改良植物性状的优点。CRISPR/Cas Type V系统是一类新发现的CRISPR系统，它具有5
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TTN的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如Cpf1,C2c1,CasX,CasY。然而目前存在的不同的CRISPR/Cas各有不同的优点和缺陷。Cas12i也属于V型CRISPR/Cas系统，中国专利(CN111757889B，公告日期：20210525)公开了一种V型Cas酶(Cas12f.4)，在本专利技术中，将Cas12f.4定义为Cas12i。Cas12i用于真核细胞基因编辑的编辑效率有待提升。
[0005]本研究通过优化的Cas12i定向编辑大豆miR396家族基因，创制出大籽粒、高产大豆的种质资源。

技术实现思路

[0006]本专利技术目的是提供一种突变的miR396及其在增大大豆籽粒、增加大豆粒重、增加大豆单株种子数或提高大豆产量中的应用。
[0007]一方面，本专利技术提供了一种突变的miR396，所述的突变的miR396相对于亲本miR396具有碱基突变，所述亲本miR396为来源于大豆的野生型miR396，所述亲本miR396选自miR396a、miR396b、miR396c、miR396d或miR396f。
[0008]在一个实施方式中，所述miR396包括miR396a、miR396c、miR396d和miR396f；在其他的实施方式中，所述miR396包括miR396a、miR396b、miR396c、miR396d和miR396f。
[0009]在一个实施方式中，所述突变的miR396选自以下一种或任意几种：
[0010](i)miR396a、miR396c、miR396d和miR396f相对于亲本miR396具有碱基突变；
[0011](ii)miR396a、miR396b、miR396c、miR396d和miR396f相对于亲本miR396具有碱基突变。
[0012]在一个实施方式中，所述突变的miR396导致大豆的籽粒增大、粒重增加、单株种子
数增加或产量提高。
[0013]在一个实施方式中，所述碱基突变包括碱基缺失、碱基插入或碱基替换。
[0014]在一个实施方式中，所述亲本miR396为来源于大豆的野生型miR396。在一个实施方式中，所述大豆为中黄302。
[0015]在一个实施方式中，所述亲本miR396a来源于大豆，且与SEQ ID No.2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
[0016]在一个具体的实施方式中，所述亲本miR396a的序列如SEQ ID No.2所示。
[0017]在一个实施方式中，所述亲本miR396b来源于大豆，且与SEQ ID No.3所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
[0018]在一个具体的实施方式中，所述亲本miR396b的序列如SEQ ID No.3所示。
[0019]在一个实施方式中，所述亲本miR396c来源于大豆，且与SEQ ID No.4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
[0020]在一个具体的实施方式中，所述亲本miR396c的序列如SEQ ID No.4所示。
[0021]在一个实施方式中，所述亲本miR396d来源于大豆，且与SEQ ID No.5所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
[0022]在一个具体的实施方式中，所述亲本miR396d的序列如SEQ ID No.5所示。
[0023]在一个实施方式中，所述亲本miR396f来源于大豆，且与SEQ ID No.6所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。
[0024]在一个具体的实施方式中，所述亲本miR396f的序列如SEQ ID No.6所示。
[0025]在一个实施方式中，所述miR396a、miR396c、miR396d和miR396f相对于野生型miR396a、miR396c、miR396d或miR396f具有碱基突变。
[0026]在一个实施方式中，所述miR396a、miR396c、miR396d和miR396f相对于野生型miR396a、miR396c、miR396d或miR396f具有碱基缺失。
[0027]在一个实施方式中，所述亲本miR396a的序列如SEQ ID No.2所示，所述突变的miR396a相对于SEQ ID No.2所示序列具有碱基缺失；所述亲本miR396c的序列如SEQ IDNo.4所示，所述突变的miR396c相对于SEQ ID No.4所示序列具有碱基缺失；所述亲本miR396d的序列如SEQ ID No.5所示，所述突变的miR396d相对于SEQ ID No.5所示序列具有碱基缺失；所述亲本miR396f的序列如SEQ ID No.6所示，所述突变的miR396f相对于SEQ ID No.6所示序列具有碱基缺失。
[0028]在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变的miR396，所述突变的miR396相对于亲本miR396具有碱基突变，所述亲本miR396为来源于大豆的野生型miR396，所述miR396包括miR396a、miR396c、miR396d和miR396f；任选的，所述miR396还包括miR396b；所述突变的miR396导致大豆的籽粒增大、粒重增加、单株种子数增加或产量提高。2.根据权利要求1所述的突变的miR396，其特征在于，所述突变的miR396选自以下一种或任意几种：(i)所述突变的miR396a相对于SEQ ID No.2所示序列具有碱基缺失；所述突变miR396c相对于SEQ ID No.4所示序列具有碱基缺失；所述突变的miR396d相对于SEQ ID No.5所示序列具有碱基缺失；所述突变的miR396f相对于SEQ ID No.6所示序列具有碱基缺失；(ii)所述突变的miR396a相对于SEQ ID No.2所示序列具有碱基缺失；所述突变的miR396b相对于SEQ ID No.3所示序列具有碱基缺失；所述突变的miR396c相对于SEQ ID No.4所示序列具有碱基缺失；所述突变的miR396d相对于SEQ ID No.5所示序列具有碱基缺失；所述突变的miR396f相对于SEQ ID No.6所示序列具有碱基缺失。3.一种载体，所述载体包含权利要求1
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2任一所述的突变的miR396。4.一种宿主细胞，所述的宿主细胞包括权利要求1
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2任一所述的突变的miR396或权利要求3所述的载体。5.一种基因编辑试剂，其特征在于，所述基因编辑试剂能够在大豆中产生权利要求1
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2任一所述的突变的miR396；所述基因编辑试剂包括Cas12i和gRNA，所述gRNA包括与Cas12i结合的骨架区以及与靶序列杂交的引导序列，所述gRNA靶向大豆中的miR396；所述Cas12i的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比，在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸和第433位氨基酸处发生突变；优选的，所述Cas12i在对应于SEQ ID No.1所示序列的第369位氨基酸突变为R，第433位氨基酸突变为R。6.权利要求1
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2任一所述的突变的miR396，权利要求3所述的载体，权利要求4所述的宿主细胞，或权利要求5所述的基因编辑试剂在制备籽粒增大、粒重增加、单株种...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢洪涛，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：