一种生成高唾液酸化蛋白药物的细胞工程方法技术

本发明专利技术公开了一种生成高唾液酸化蛋白药物的细胞工程方法，涉及生物技术领域。所述方法用到的融合蛋白为β

【技术实现步骤摘要】
一种生成高唾液酸化蛋白药物的细胞工程方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种生成高唾液酸化蛋白药物的细胞工程方法。

技术介绍

[0002]IgG抗体药物的可结晶片段(Fc片段)的N297位存在一个保守的N糖基化位点，其连接的N糖的糖链组成和结构对IgG抗体的功能具有重要影响。研究发现静脉注射免疫球蛋白(IVIG)抗炎作用的发挥依赖于IgG抗体Fc片段上N297位糖链末端修饰的唾液酸，且唾液酸以α
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2,6连接到糖链的倒数第二个半乳糖上。然而，从人体血液中提纯得到的IVIG其唾液酸化水平普遍较低。因此，生产具有高唾液酸修饰水平的IgG抗体对其抗炎作用的研究和炎症疾病的治疗都具有重要意义。由于使用普通工程细胞(如：CHO细胞)生产的IgG的糖链唾液酸修饰水平很低，因此，通过对工程细胞糖基化相关基因进行改造，提高IgG糖链的唾液酸化修饰水平，对生产具有抗炎活性的IgG抗体药物具有重要意义。
[0003]N糖基化是蛋白质重要的翻译后修饰，起始于细胞内质网，完成于高尔基体中，由一系列的糖基转移酶逐个添加不同的糖单元组装而成。未经改造的工程细胞所生产的IgG抗体，在N297位修饰的糖链主要是不含半乳糖的双天线复合糖型(G0F型，图1)，需要通过β
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1,4
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半乳糖基转移酶(B4GALT1)和β
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半乳糖苷α
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2,6
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唾液酸转移酶1(ST6GAL1)两步催化，才能组装成为具有抗炎活性的唾液酸修饰糖型(G2FS1/G2FS2型,图1)。然而，可能由于N297糖基化位点在IgG抗体结构中空间受限，工程细胞内源表达的B4GALT1和ST6GAL1对该位点的糖链催化效率低。
[0004]相关技术中，生产高唾液酸IgG抗体的方法分为体外酶催化和细胞糖工程两类。体外酶催化方法包括：1.通过采用重组表达的糖基转移酶B4GALT1、ST6GAL1和合成制备的糖基供体底物与IgG抗体共孵育反应，在IgG抗体的N297位糖链上依次添加半乳糖和唾液酸；2.先通过内切糖苷酶(endoglycosidases，EndoS)去除掉IgG抗体上的N
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聚糖，然后使用具有转糖酶活性的EndoS突变体将有机合成的带有唾液酸修饰的完整糖链整体添加到IgG抗体的N297位。体外酶催化反应虽然效率高，但由于需要额外制备糖基转移酶、糖苷酶和糖基供体等底物，而且需要额外的纯化步骤，其生产成本相应较高，难以实现工业化生产。细胞糖工程方法通过瞬时转染、稳定转染或者定点敲入特定基因的方式在宿主细胞中对糖链中唾液酸的生物合成途径进行改造，从而提高工程细胞生产高唾液酸修饰IgG的能力。包括：过表达编码唾液酸糖基供体转运蛋白(CMP
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sialic acid transporter)的基因；同时过表达编码糖基转移酶B4GALT1和ST6GAL1的两个基因。但上述方案生产的IgG抗体的唾液酸修饰程度均较低，仅能得到IgG抗体药物的部分单唾液酸修饰(G2FS1型)和极少量的双唾液酸修饰(G2FS2型)。
[0005]因此，如何通过经济有效的方法获得高度唾液酸修饰的IgG抗体或蛋白药物具有重要的社会价值。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种融合蛋白，通过与目标蛋白在细胞中共表达，能够有效提高目标蛋白的唾液酸修饰程度。
[0007]本专利技术还提供一种编码上述融合蛋白的核酸分子。
[0008]本专利技术还提供一种重组载体。
[0009]本专利技术还提供一种重组生物细胞。
[0010]本专利技术还提供一种产品。
[0011]本专利技术还提供一种提高蛋白的唾液酸修饰程度的方法。
[0012]本专利技术还提供由上述提高蛋白的唾液酸修饰程度的方法制备得到的蛋白。
[0013]本专利技术还提供上述融合蛋白/核酸分子/重组载体/产品/方法在制备含唾液酸化糖型的蛋白中的应用。
[0014]根据本专利技术的第一方面实施例的一种融合蛋白，所述融合蛋白为β
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半乳糖苷α
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2,6
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唾液酸转移酶1的催化结构域与β
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1,4
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半乳糖基转移酶融合得到的融合蛋白。
[0015]根据本专利技术的一些实施例，所述β
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半乳糖苷α
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2,6
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唾液酸转移酶1的催化结构域为A1)至A4)任一项，
[0016]A1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1第429～764位所示的蛋白质；
[0017]A2)氨基酸序列如SEQ ID NO.1第492～764位所示的蛋白质；
[0018]A3)将A1)或A2)中所述氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且同时具有β
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半乳糖苷α
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2,6
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唾液酸转移酶1活性的蛋白质；
[0019]A4)在A1)或A2)或A3)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的蛋白质。
[0020]根据本专利技术的一些实施例，所述β
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1,4
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半乳糖基转移酶为B1)或B2)或B3)，
[0021]B1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1第1～393位所示的蛋白质；
[0022]B2)将B1)中所述氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且同时具有β
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1,4
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半乳糖基转移酶活性的融合蛋白；
[0023]B3)在B1)或B2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的蛋白质。
[0024]根据本专利技术的一些实施例，所述β
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半乳糖苷α
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2,6
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唾液酸转移酶1的催化结构域与所述β
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1,4
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半乳糖基转移酶通过非剪切性连接肽连接。
[0025]根据本专利技术的一些实施例，所述非剪切性连接肽为非剪切性柔性连接肽。本领域技术人员可以依据目标蛋白或多肽对连接肽进行选择。例如，所述非剪切性柔性连接肽可以为SEQ ID NO.1第409～428位所示氨基酸序列，也可以为GGGSGGSG、(GGGGS)6、(GGGGS)5、(GGGGS)4、(GGGGS)3、(GGGGS)2、GGGGS、GGGG、GSGGSG、GSGGSGGGSGGSGGG、GGGGSGGG、GSGGSGGG或GGGGSGGGSGG。
[0026]根据本专利技术的一些实施例，所述蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签蛋白、His标签蛋白、MBP标签蛋白、HA标签蛋白、myc标签蛋白、GST标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为β
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半乳糖苷α
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2,6
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唾液酸转移酶1的催化结构域与β
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1,4
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半乳糖基转移酶融合得到的融合蛋白。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述β
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半乳糖苷α
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2,6
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唾液酸转移酶1的催化结构域为A1)至A4)任一项，A1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1第429～764位所示的蛋白质；A2)氨基酸序列如SEQ ID NO.1第492～764位所示的蛋白质；A3)将A1)或A2)中所述氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且同时具有β
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半乳糖苷α
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2,6
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唾液酸转移酶1活性的蛋白质；A4)在A1)或A2)或A3)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的蛋白质；优选地，所述β
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1,4
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半乳糖基转移酶为B1)或B2)或B3)，B1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1第1～393位所示的蛋白质；B2)将B1)中所述氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且同时具有β
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1,4
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半乳糖基转移酶活性的融合蛋白；B3)在B1)或B2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的蛋白质；优选地，所述β
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半乳糖苷α
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2,6
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唾液酸转移酶1的催化结构域与所述β
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1,4
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半乳糖基转移酶通过非剪切性连接肽连接。3.一种编码如权利要求1或2所述融合蛋白的核酸分子。4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子中，用于编码所述β
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半乳糖苷α
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【专利技术属性】
技术研发人员：毛洋，袁燕秋，马如花，何羽骐，梁敏婷，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：