一种酯酶基因及其编码蛋白、固定化酶制剂的方法和应用技术

本发明专利技术公布一种酯酶基因及其编码蛋白、固定化酶制剂的方法和应用。该酯酶基因estE核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其编码的蛋白质EstE氨基酸序列为SEQ ID NO.2。通过异源表达获得estE的产物酯酶EstE，随后以其为目标物，金属有机框架为载体制备固定化酯酶制剂。所述固定化酯酶制剂具有较高的固定化效率及良好的活性，固定化效率为94％，酶活性为54U/mg；与游离酶相比，提高了对反应环境和有机溶剂及去垢剂的耐受性；可循环利用，经过10次的重复使用后，固定化酶制剂仍达到原始酶活性的45％以上，展现了良好的重复使用性能。该酶制剂在医药合成、农药降解、环境治理等领域具有广泛的应用价值。价值。价值。

【技术实现步骤摘要】
一种酯酶基因及其编码蛋白、固定化酶制剂的方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，特别涉及酯酶基因及其编码蛋白、固定化酶制剂的方法和应用。

技术介绍

[0002]酯酶(EC 3.1.1.X，esterase)是一类参与转酯、酯化和酯交换等多种反应的丝氨酸水解酶，在有机相中能催化酯键形成，在水相中可催化酯键裂解，该酶具有优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性，可以应用于农药降解、环境治理以及医药合成等领域。酯酶可在动植物及微生物中分离获得，产量有限；由于微生物生长繁殖快、培养方法简单、对营养需求低且产酶量大，寻求在微生物中能表达的高催化效率的酯酶一直是人们努力的目标。
[0003]作为一种天然的生物催化剂，酯酶与传统的化学催化剂相比，具有超高的催化效率、更加优异的催化性能且绿色环保无污染。然而，游离酶的催化效率易受到pH、温度、非水溶剂等环境因素的影响，在使用过程中稳定性较差。另外，蛋白酶一般为水溶性，在使用完毕后很难将其从反应体系中分离出来，难以重复使用，极大地增加了生产成本，限制了生物酶在工业生产中的应用。
[0004]固定化酯酶制剂不仅能够提高酯酶的操作稳定性和重复使用性，而且在减少加工步骤的同时减少催化剂生产成本。因此，通过固定化技术将酯酶固定于不溶于水的载体上制成固定化酯酶制剂，可极大的改善这些缺点。制备固定化酯酶制剂的关键是载体材料的选择。常规固体载体包括多孔玻璃、二氧化硅、金属氧化物无机材料和壳聚糖、树脂类、聚丙烯酰胺有机高分子材料。然而，这些传统的酶载体并不具有良好的可调性和结晶性，这可能会导致蛋白装载效率低、不稳定以及酶易浸出的缺陷，进而影响固定化酶制剂的活性。金属有机框架(MOF)是由金属离子和有机配体通过强配位键组成的一种多孔晶体杂化材料，具有可调的孔隙大小、高比表面积、良好的化学和热稳定性以及无毒性等诸多优点，有望成为固定化酶制剂的新型优良载体。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的第1个技术问题是提供一种微生物中能表达的高催化效率的酯酶基因。
[0006]本专利技术所要解决的第2个技术问题是上述酯酶基因在大肠杆菌中的异源表达以获得酯酶基因的编码蛋白。
[0007]本专利技术所要解决的第3个技术问题是固定上述酯酶的酶制剂的方法。
[0008]本专利技术所要解决的第4个技术问题是固定上述酯酶的酶制剂的应用。
[0009]本专利技术解决第1个技术问题的技术方案为：一种酯酶基因，它含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸的序列。
[0010]一种酯酶基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0011]一种载体，所述的载体为重组质粒，该重组质粒为含有所述的酯酶基因的pET28b
‑
estE。
[0012]一种宿主，所述的宿主为酯酶重组工程菌，该工程菌为大肠杆菌且含有所述的重组质粒表达载体以及核苷酸序列。
[0013]所述的重组工程菌通过表达estE得到，诱导表达条件为：IPTG的诱导浓度为0.01
‑
0.5mM，诱导表达温度为15
‑
37℃。
[0014]所述的固定化酯酶制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0015](1)将酯酶溶液与2
‑
甲基咪唑溶液混合后振荡10
‑
90s，再加入乙酸锌溶液振荡10
‑
90s，此混合溶液中酯酶终浓度为0.1
‑
0.8mg/mL、乙酸锌的终浓度是0.02
‑
0.06M、2
‑
甲基咪唑的终浓度为0.20
‑
1.00M，充分混匀后在20
‑
60℃水平摇床中反应10
‑
90min；
[0016](2)再将上述反应得到的混合物离心，得到上清液和离心产物；
[0017](3)将步骤(2)所述离心产物使用超纯水洗涤3次并在室温下干燥至恒重，得到固定化酯酶制剂。
[0018]优选的酯酶浓度为0.4mg/mL、乙酸锌的浓度为0.04M、2
‑
甲基咪唑的浓度为0.80M。
[0019]所述的固定化酯酶制剂在医药合成、农药降解以及环境治理的应用。
[0020]本专利技术的酯酶由人工设计合成的estE基因所编码，通过estE与重组质粒连接构建表达载体，并将其转化大肠杆菌感受态细胞，构建基因工程菌并采用Co
2+
离子亲和层析获得。
[0021]固定化酯酶制剂(EstE@MOF)以经Co
2+
离子亲和层析获得的纯化酯酶EstE为目标物，金属有机框架为固定化载体制备而得。相对于游离酶，固定化酯酶制剂具有良好的温度、pH和化学稳定性、超高的孔隙率、巨大的比表面积和优良的可重复利用性。
[0022]本专利技术所制备的固定化酯酶制剂是由锌离子与2
‑
甲基咪唑配位而成的MOF纳米晶体的生长过程中将酯酶封装所合成的制剂，由于酯酶包埋在MOF内部区域，不易泄露，从而具有良好的稳定性和较高的酶活性。
[0023]本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果
[0024]1.本专利技术合成了酯酶estE基因，并将其与pET28b质粒连接构建具卡那霉素(Kan)和氯霉素(Cam)抗性的重组表达载体pET28b
‑
estE，将该重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，成功构建用于estE表达的基因工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b
‑
estE，随后通过Co
2+
离子亲和层析，获得高度纯化酯酶蛋白。
[0025]2.本专利技术釆用生物矿化法，以MOF为载体在常温常压条件下成功制备了固定化酯酶制剂。其与游离酶相比，具有较大的比表面积、功能定制的孔隙大小、无毒性、合成过程简单特点，进一步提高了对反应环境和有机溶剂及去垢剂的耐受性，优选所述固定化酯酶制剂对于有机溶剂乙腈、丙酮和去垢剂STAB、SDS有良好的耐受性。分别加入15％乙腈、15％丙酮、1％CTAB和1％SDS后，残余酶活分别为71.25％、77.81％、84.86％和77.02％；展现了良好的重复使用性能，经过10次的循环使用后EstE@MOF仍能保留45％以上的残余酶活，其合成条件温和、反应时间短，且操作简单，易于推广。
[0026]3、本专利技术所使用的MOF载体具有酶专一性，用该MOF载体分别制备固定化风味酶制剂、木瓜蛋白酶制剂、谷氨酰胺转移酶酶制剂、无花果蛋白酶制剂，其酶活仅分别保留了游离酶酶活的52.6％、6.0％、4.1％和0.3％。
附图说明
[0027]图1实施例3所制的酯酶的SDS
–
PAGE图。
[0028]图2实施例6中乙酸锌摩尔浓度与酯酶固定化效率图。
[0029]图3实施例7中2
‑
甲基咪唑摩尔浓度与酯酶固定化效率图。
[0030]图4为实施例3所制备的固定化酯酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酯酶编码基因，其特征在于：具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列。2.一种酯酶基因的编码蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.一种载体，其特征在于：其含有权利要求1所述的基因编码序列。4.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求1所述的基因序列，和含有权利要求3所述的载体。5.权利要求1所述的固定化酯酶制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将酯酶溶液与2
‑
甲基咪唑溶液混合后振荡10
‑
90s，再加入乙酸锌溶液振荡10
‑
90s，此混合溶液中酯酶终浓度为0.1
‑
0.8mg/mL、乙酸锌的终浓度是0.02
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宝娟，房金鑫，高鹏，吴爽，杨骁骐，施金叶，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：