通过介孔二氧化硅纳米颗粒递送外源核酸到植物细胞制造技术

本发明专利技术公开了一种基于介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)向植物细胞递送质粒DNA和RNA的方法。所述的介孔二氧化硅纳米颗粒能够高效负载质粒DNA和RNA，能够将其递送至植物例如烟草叶片及水稻愈伤组织细胞中，并实现报告基因的表达。本发明专利技术提供的介孔二氧化硅纳米颗粒具有可控且较小的粒径。10

【技术实现步骤摘要】
通过介孔二氧化硅纳米颗粒递送外源核酸到植物细胞


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及递送外源核酸序列到植物细胞中的介孔二氧化硅纳米颗粒复合物以及相应的转化方法。

技术介绍

[0002]植物核酸序列递送系统
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将外源核酸序列导入植物细胞的方法，是植物重要性状功能基因鉴定的前提和分子育种的基础，是植物分子育种技术中一项最基本的技术。根据转化过程中是否使用载体介导，通常可以分为载体介导转化和直接遗传转化。常用的载体介导法主要通过农杆菌侵染、病毒侵染、基因枪轰击和花粉管管道介导等转化方法进行遗传转化。但是农杆菌侵染法在双子叶植物种效率较高，而在单子叶植物种需要大量的摸索；病毒侵染法虽然在短时间内可获得较大的表达量，但每个宿主材料都要接种病毒载体，存在植株感染病毒的风险；基因枪法是常用的转基因手段，但是转化效率低、会产生大量嵌合体等问题，且不同的植物组织及材料会需要摸索不同的攻击速度；花粉管管道介导的基因转化方式则依赖于植物的开花授粉的时期。针对上述植物转基因技术当中的一些限制，研发新的基因编辑方法和挖掘新的核酸序列载体成为植物分子育种研究中的热点。
[0003]随着纳米生物技术的发展，纳米颗粒作为基因载体已广泛应用于动物细胞、医学领域和基因治疗等领域。纳米颗粒因其具有较大的比表面积可以高效的负载外源基因，且其毒性小、生物相容性好，能够保护外源基因免受核酸降解酶的干扰，相对于农杆菌或病毒改造的植物基因递送系统，纳米颗粒具有制备容易、稳定性好、容易修饰、生物和环境安全性高、能够跨物种转化等特点，正逐渐发展成为一类高效的植物基因编辑技术。
[0004]根据纳米材料的组成，可分为无机纳米材料和有机高分子纳米材料，目前应用于植物遗传转化的纳米基因载体以无机物纳米材料为主，包括以四氧化三铁构建的磁性纳米颗粒，以碳原子构成的单壁碳纳米管，以二氧化硅骨架构成的介孔二氧化硅纳米载体及胶体金纳米颗粒。这些纳米载体在对植物进行遗传转化时会使用到外力如磁场、真空和基因枪轰击的方法。因此，业内亟需一种简单可行、不借助外力因素的基于纳米颗粒介导的植物遗传转化方法。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术方法存在的限制，本专利技术目的之一在于提供一种介孔二氧化硅纳米颗粒(Mesoporous Silica Nanoparticle，MSN)与DNA和/或RNA的复合物。本专利技术另一目的在于提供一种基于纳米颗粒的植物遗传转化方法，简单可行、不借助外力因素。
[0006]本专利技术的技术方案如下：本专利技术所述的介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)与DNA和/或RNA通过静电结合的复合物，其特征在于，MSN表面进行了正电荷修饰，由此可结合核酸分子包括DNA和RNA例如siRNA、mRNA等。根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的定义，孔径小于2nm的称为微孔；孔径大于50nm的称为大孔；孔径在2
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50nm的称为介孔。在本专利技术技术方案中，MSN小于30纳米直径；优选方案是具有10
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30纳米直径。可以按照任何已知方法进行正
电荷修饰，比如通过3
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氨丙基三乙氧基硅(APTS)、聚乙烯亚胺或聚乙二醇
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硅烷进行修饰，优选方案是在MSN表面修饰APTS。将含有外源基因的质粒或RNA与具有10
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30纳米直径、表面进行了正电荷修饰比如修饰有3
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氨丙基三乙氧基硅(APTS)的介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)相连接，得到DNA
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MSN/RNA
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MSN复合物。
[0007]所述质粒可以是pBI221
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GFP，优选的质粒包括植物基因过表达质粒和植物CRISPR基因编辑质粒。所述RNA包括siRNA和MRNA，例如siRNA为烟草的ROQ1基因上的靶标序列，优选的siRNA序列包括烟草和水稻所有功能基因的靶标序列。所述的mRNA为经体外转录并修饰后能在植物内正常表达的功能基因序列，优选的包括烟草和水稻所有功能基因的mRNA序列。
[0008]本专利技术还涉及到一种MSN的制备方法，通过以十六烷基三甲基溴化铵、正硅酸乙酯、氨水作为原材料合成得到。专利技术人发现，氨水的用量或者浓度和得到的MSN的粒径直接相关，氨水的用量越大MSN的粒径越大，由此可以通过氨水的用量或者浓度来调控MSN的粒径，比如将MSN的粒径控制在10
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30nm、50
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60nm、80
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100nm或180
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200nm等。
[0009]本专利技术所述的基于纳米颗粒的植物遗传转化方法，其特征在于，将所述DNA
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MSN/RNA
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MSN复合物与植物愈伤组织例如水稻愈伤组织共孵育，从而将外源基因递送至植物细胞；或者将所述DNA
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MSN/RNA
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MSN复合物通过叶片注射而将外源基因递送至植物细胞例如本氏烟草。
[0010]本专利技术与现有技术相比，有益效果在于：操作过程简单，只需将MSN颗粒与质粒DNA或siRNA直接孵育即可制成复合物；操作时间短，MSN颗粒与核酸序列直接孵育60min后可直接注射烟草叶片或滴加至水稻愈伤后即可实现转化；在水稻愈伤中转化效率高，滴加MSN颗粒与质粒的水稻愈伤的组织6d时可实现大于60％的转化效率。本专利技术提供了一个简单的、可重复的基于纳米颗粒介导的直接递送外源核酸序列的转化方法，特别是相对于基因枪轰击所采用的MSN，本专利技术提供的MSN具有更小的粒径，无需借助外力即能穿越细胞壁递送外源核酸序列，这为植物基因功能的研究提供了重要的转化工具，也为利用基因编辑工具培育新品种奠定了基础。
附图说明
[0011]说明书附图用来帮助对本专利技术的进一步理解，因而构成本申请的一部分。但是，说明书附图仅仅用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的任何限定。
[0012]图1：为实施例1MSN颗粒的透射电子显微镜图。其中A：粒径为10
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30nm；B：粒径为50
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60nm；粒径为80
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100nm；D：粒径为180
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200nm。
[0013]图2：为实施例2外源质粒载体的结构示意图。
[0014]图3：为实施例3ROQ1
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siRNA的碱基序列示意图。
[0015]图4：为实施例4的MSN负载外源DNA(a)和siRNA(b)的琼脂糖凝胶电泳图。
[0016]图5：为实施例4DNA
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MSN复合物的透射电子显微镜图。
[0017]图6：为实施例5的烟草叶片侵染siRNA
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MSN复合物后mRNA表达量变化的示意图。
[0018]图7：为实施例5的烟草叶片侵染DNA
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MSN复合物激光共聚焦显微镜图，分别为烟草叶片表皮细胞的绿色荧光，明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)与外源DNA和/或RNA通过静电结合的复合物，其特征在于，所述MSN表面进行了正电荷修饰，而且所述MSN具有小于30纳米的直径。2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述MSN具有10
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30纳米直径。3.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述外源DNA包括质粒，例如pBI221
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GFP，优选的质粒包括植物基因过表达质粒和植物CRISPR基因编辑质粒；所述外源RNA包括siRNA和mRNA。4.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述MSN表面通过3
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氨丙基三乙氧基硅、聚乙烯亚胺或聚乙二醇
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硅烷进行正电荷修饰。5.一种MSN的制备方法，其特征在于，通过以十六烷基三甲基溴化铵、正硅酸乙酯、氨水作为原材料合成得到，并且通过氨水的用量或者浓度来调控MSN的粒径。6.根据权利要求5所述的MSN的制备方法，其特征在于，所制备的MSN的粒径范围在10
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30nm、50
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60nm、...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹宇虹，蔡垚，刘祝江，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：