一种重组流感病毒基因治疗药物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种体内基因递送系统及其应用。本发明专利技术涉及一种重组病毒，其中包含甲型流感病毒和编码人混合谱系激酶结构域样(MLKL)蛋白的基因。通过将MLKL装载到甲型流感病毒基因，局部应用本基因递送系统，在病毒自身复制的同时表达MLKL，加强细胞坏死性凋亡，从而增加细胞免疫原性死亡比例，并进一步激活机体免疫反应，以达到杀伤肿瘤，激活抗肿瘤免疫的效果。本发明专利技术提供了一种靶向杀伤肿瘤细胞的重组溶瘤病毒，而对正常宿主细胞无明显影响，可用于肿瘤的靶向治疗。可用于肿瘤的靶向治疗。可用于肿瘤的靶向治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种重组流感病毒基因治疗药物及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种重组流感病毒基因治疗药物及其应用。

技术介绍

[0002]肿瘤是世界上人类健康的主要威胁之一。现在肿瘤治疗的主要手段有外科治疗，化疗、放疗以及免疫治疗、靶向治疗等，虽然具有一定疗效，但仍然存在着副作用大、疗效有限、难以根治、耐药、复发等问题，对机体正常细胞也会造成巨大伤害。因此如何高效、特异地杀伤肿瘤细胞是当今肿瘤治疗的一大挑战。随着分子生物学的发展以及人们在基因水平对肿瘤的认识提高，近年来溶瘤病毒为肿瘤治疗提供了新的思路。
[0003]甲型流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)，属于正黏病毒科，流行性感冒病毒属的代表种；PR8是由8个单股负链、分节段RNA组成；共编码10种蛋白；RNA前3个节段分别编码聚合酶碱性蛋白2(Polymerase Basic Protein 2，PB2)、聚合酶碱性蛋白1(Polymerase Basic Protein 1，PB1)和聚合酶酸性蛋白(Polymerase Acid Protein，PA)，后5个节段编码血凝素(Hemagglutinin，HA)，核蛋白(NP)，神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)，基质蛋白(Matrix Protein，M1和M2)和非结构蛋白(Nonstructural，NS1和NS2)。近年来发现它不仅具有溶瘤作用，还能激活机体免疫反应。
[0004]现有的肿瘤治疗的方法无论是靶向治疗还是免疫治疗都只能针对肿瘤细胞本身所表达的蛋白通过单抗封闭的手段抑制其功能从而达到杀伤肿瘤细胞的作用，并没有从基因表达层面上，通过干预基因表达，尤其是过表达抑癌基因的治疗方法和手段；而这些现有治疗方法不仅手段有限，主要缺点是人为屏蔽自身表达的基因导致副作用严重，亟需更好的方法作为治疗的补充。另外，既往的溶瘤病毒选择的都是腺病毒、单纯孢疹病毒、牛痘病毒等作为病毒载体，病毒载体的种类有待进一步丰富和拓展。

技术实现思路

[0005]基于现有技术中存在的缺陷，本专利技术人通过长期研究和大量试验发现与现有技术中通常使用的病毒相比，流感病毒除了同样能杀伤肿瘤细胞外，还明确能引起肿瘤细胞坏死性凋亡，引起机体更强的免疫反应。本专利技术通过在流感病毒上变达坏死性凋亡的效应蛋白MLKL，使肿瘤细胞表达更多MLKL，进而细胞增加坏事性凋亡，从而使机体免疫反应更强烈。
[0006]混合谱系激酶区域样蛋白(mixed
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lineage kinase domain
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like protein，MLKL)是一种坏死性凋亡的效应蛋白，本专利技术通过将MLKL装载到甲型流感病毒基因，局部应用本基因递送系统，在病毒自身复制的同时表达MLKL，加强细胞坏死性凋亡，从而增加细胞免疫原性死亡比例，并进一步激活机体免疫反应，以达到杀伤肿瘤，激活抗肿瘤免疫的效果。从而完成了本专利技术，即本专利技术如下所述：
[0007]本专利技术在第一方面提供了一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒中包含甲型流感病毒的基因组片段和编码混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)的基因。
[0008]在一些具体的实施方式中，将所述编码MLKL蛋白的基因装载到所述甲型流感病毒的基因组中。
[0009]在另外一些具体的实施方式中，所述甲型流感病毒的基因组片段包含编码聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶酸性蛋白(PA)、血凝素(HA)，核蛋白(NP)，神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)的基因序列。
[0010]在一些具体的实施方式中，其中，(i)所述编码MLKL的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述MLKL的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或者(ii)所述编码MLKL的核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性；所述MLKL的氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
[0011]在一些具体的实施方式中，其中所述甲型流感病病毒的毒株为A/Puerto Rico/8/34。
[0012]本专利技术在第二方面提供了一种药物组合物，其含有药学上可接受的载体和本专利技术在第一方面中所述的重组病毒。
[0013]本专利技术在第三方面提供了一种如本专利技术在第一方面中所述的重组病毒在作为RNA/基因递送载体中的用途。
[0014]本专利技术在第四方面提供了一种如本专利技术在第一方面中所述的重组病毒或如本专利技术在第二方面中所述的药物组合物在制备抑制或杀死肿瘤细胞的药物中的用途；在一些优选的实施方案中，所述肿瘤是选自由头颈部、肺、乳腺、胰腺、肾、肝、胃、结肠、卵巢、子宫、前列腺、膀胱或血液组成的组中的任一项中的肿瘤。
[0015]本专利技术在第五方面提供了一种如本专利技术在第一方面中所述的重组病毒或如本专利技术在第二方面中所述的药物组合物在制备激活机体免疫系统能力的药物中的用途。
[0016]本专利技术的总流程为：将PHW2000载体与流感病毒的PA基因连接，构成pHW
‑
PA重组载体，然后将pHW
‑
PA重组载体与MLKL基因连接构成pHW
‑
PA
‑
MLKL重组质粒，再将所述重组质粒与其余的重组流感病毒质粒(即包含流感病毒基因组中其它基因片段的重组流感病毒质粒)共同转染到293T细胞制成重组流感病毒，并通过鸡胚扩增所述重组流感病毒后于体内、外验证所述重组流感病毒的杀伤作用(具体参见图1)。
[0017]技术效果
[0018]1.本分专利技术所用甲型流感病毒与腺病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、柯萨基病毒、麻疹病毒等溶瘤病毒相比，具有毒性低，安全性较高，靶向性高的优点；并且其本身不仅能裂解肿瘤细胞，还能引起肿瘤细胞坏死性凋亡，激活机体免疫系统。
[0019]2.本专利技术在甲型流感病毒上表达MLKL蛋白，能进一步增强甲型流感病毒杀伤肿瘤细胞能力以及激活机体免疫系统能力。
[0020]3.本专利技术提供的基于A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)甲流病毒的递送系统对人体无明显毒性，操作简单且能直接体内递送目的基因。
附图说明
[0021]图1为本专利技术总流程图；
[0022]图2为PHW2000
‑
PA
‑
MLKL质粒图部分片段；
[0023]图3为MLKL RT
‑
PCR电泳结构图；
QGYQVKLAGF ELRKTQTSMS LGTTREKTDR VKSTAYLSPQ ELEDVFYQYD VKSEIYSFGI VLWEIATGDIPFQGCNSEKI RKLVAVKRQQ EPLGEDCPSE LREIIDECRA HDPSVRPSVD EILKKLSTFSK
[0036]将pHW2000
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒中包含甲型流感病毒的基因组片段和编码混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)的基因。2.如权利要求1所述重组病毒，其中，将所述编码MLKL蛋白的基因装载到所述甲型流感病毒的基因组中。3.如权利要求1所述重组病毒，其中，所述甲型流感病毒的基因组片段包含编码聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、聚合酶酸性蛋白(PA)、血凝素(HA)，核蛋白(NP)，神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)的基因序列。4.如权利要求1所述的重组病毒，其中，(i)所述编码MLKL的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述MLKL的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或者(ii)所述编码MLKL的核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性；所述MLKL的氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有90％、92％、...

【专利技术属性】
技术研发人员：李谨，宋文俊，张振辉，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院广州呼吸中心，
类型：发明
国别省市：